Vor kurzem wurde entdeckt, dass Telomere in eine nicht-kodierende RNA genannt telomeric repeat containing RNA (TERRA) oder auch telomerische RNA (telRNA) transkribiert werden. TERRA fungiert als natürlicher Ligand und Hemmstoff für die Telomerase, dem Enzym das von ca. 85% der Tumorzellen verwendet wird, um Telomerlängen aufrecht zu erhalten und damit eine uneingeschränkte Anzahl von Zellteilungen zu ermöglichen. In der Literatur ist bekannt, dass unterschiedliche Promotoren für die Expression zuständig sind und das polyadenylierte und nicht-polyadenylierte TERRAs existieren, wobei nur die Nicht-polyadenylierte an den Chromosomenenden lokalisiert ist.
Der Transkriptionsstartpunkt von TERRA Transkripten ist in der subtelomerischen Region lokalisiert. Aus diesem Grund besteht auch ein Teil der TERRA Transkripte aus subtelomerischen Sequenzen.
Der Methylierungsgrad der subtelomerischen Regionen unterscheidet sich in verschiedenen Tumor Zelllinien. In einer unserer vorangegangenen Studien wurde der Methylierungsgrad der CpG Inseln der Chromosomenenden 2p TERRA Promoter Regionen von Saos-2 und T98-G mittels aufwendiger Bisulfit Konvertierung untersucht. Wir fanden eine CpG Position in dieser Promoter Region die sich in der Erkennungssequenz und Schnittstelle eines Restriktionsenzym befindet.
In meiner Studie wurden pENTR-Vektoren und anschließend adenovirale Vektoren mit Promtoren für verschieden RNA-Polymerasen, mit einem 0,8kb Telomer-Fragment in sense und antisense Orientierung produziert. Diese Vektoren dienen zukünftigen Expressions- und Inhibitorstudien.
Zell-Zyklus-FACS Analysen zeigten den Einfluss der Konfluenz auf den Zell-Zyklus Status und Real-Time PCRs den Einfluss der Konfluenz auf das TERRA Expressionslevel. Die untersuchten Telomerase negativen Zelllinien die ALT (Alternative lengthening of telomeres) assoziiert sind, zeigten im Vergleich mit den Telomerase positiven Zelllinien allgemein höhere TERRA-Werte. Ausserdem konnte bei allen Zelllinien ein Trend von erhöhter TERRA-Expression mit steigender Konfluenz ermittelt werden.
Chromosomenenden spezifische 2p, 18p, 10p und 10q TERRA Expression wurde mit spezifischen Primern gemessen und es wurden unterschiedliche Expressionslevels in den untersuchten Zelllinien gefunden.
Der neu entwickelte methylierungsspezifische Real-Time PCR Assay ermöglicht die Berechnung des Methylierungsgrades einer CpG-Insel im Chromosomenende 2p TERRA Promoter. Wenn es möglich ist andere Loci wie diesen in anderen subtelomerischen TERRA Promoter Regionen zu finden, könnten weitere Assays entwickelt werden.
Die Erkenntnisse dieser Studie werden als Startpunkt für zukünftige Studien und Untersuchungen dienen. Die erstellten Konstrukte spielen eine wichtige Rolle um neue Erkenntnisse über TERRA-Expression, -Regulierung und -Funktion zu gewinnen und dienen vielleicht dazu neue Mechanismen der Telomerase Inhibierung und damit auch der Tumorinhibierung zu entwickeln.Recently it was discovered that telomeres are transcribed into a non-coding RNA called telomeric repeat-containing RNA (TERRA) or telomeric RNA (telRNA). TERRA acts as a natural ligand and inhibitor of telomerase, the enzyme that is used by about 85% of tumor cells to maintain telomere length, which allows an unlimited number of cell divisions. In the literature it is known that different promoters are responsible for TERRA-expression and that non-polyadenylated and polyadenylated TERRAs exist, but only non-polyadenylated is localized at chromosome ends.
The transcription start point of TERRA transcripts is localized in the subtelomeric region. For this reason, parts of TERRA transcripts are subtelomeric derivation.
The methylation levels of subtelomeric regions differ in several tumor cell lines. In our previous study, methylation levels of CpG islands of chromosome end 2p TERRA promoter region of Saos-2 and T98-G were examined, by the laborious technique of bisulfit conversion. We found a CpG position in this promoter region, located in the recognition and cutting site of a restriction enzyme.
In my study, pENTR vectors and then adenoviral vectors were produced with promotors for different RNA polymerases and with a 0.8kb telomere fragment in sense and antisense orientation. These vectors serve for future expression and inhibitor studies.
Cell cycle FACS analysis showed the influence of confluence on cell cycle state and Real-time PCR the effect of confluence on TERRA expression level. The investigated telomerase negative cell lines which are associated to ALT (alternative lengthening of telomeres), showed, in comparison to telomerase positive cell line generally higher TERRA levels. Also in all cell lines a trend of increasing TERRA expression by increasing confluence could be determined.
Chromosome end specific 2p, 18p, 10p and 10q TERRA expression levels were measured using specific primers and determined levels differ in the examined cell lines.
The newly developed methylation-specific Real-time PCR assay allows calculations of methylation grade of a CpG island of chromosome end 2p TERRA promoter. Perhaps it is possible to find other loci such as those in other subtelomeric TERRA promoter regions and to develop additional assays.
The findings from this study will serve as a starting point for future studies and investigations. The generated constructs play an important role to new insights into TERRA-expression, regulation and function and perhaps serve to develope new mechanism of telomerase inhibition and hence tumor inhibition
