Proteine der EB1 (End Binding 1) - Familie sind konservierte Regulatoren der Mikrotubuli (MT) -Dynamik in allen Eukaryoten. Sie binden spezifisch an die Plus-Enden der Mikrotubuli, transportieren assoziierte Faktoren und regulieren so die Interaktion von Mikrotubuli mit zellulä-ren Strukuren, beispielsweise mit Kinetochoren oder mit dem Zellkortex. Trotz vielfältiger Funk-tionen in der Zelle sind die molekularen Mechanismen, die der Aktivität dieser Proteine zugrunde liegen, großteils unbekannt.
In dieser Arbeit zeige ich, dass das Hefe EB1 Protein Bim1 von der konservierten Kinase Aurora B/Ipl1 reguliert wird und zwar durch Phosphorylierung an der Linkerdomaene. Detaillierte biochemische Studien haben gezeigt, dass Bim1 physisch mit der Ipl1 Kinase interagiert und dass diese, nach vorangehender Aktivierung durch Sli15, Bim1 an sechs direkt benachbarten Stellen in der flexiblen Linkerdomäne phosphoryliert.
Bim1 wird im Laufe des Zellzyklus in der Anaphase phosphoryliert und kontrolliert so die Kinetik der Spindelelongation und spielt eine wichtige Rolle im effizienten Abbau ausgehend vom Zentrum der Spindel. Rekombinant hergestelltes Bim1 welches vom Ipl1-Sli15 Komplex phosphoryliert wurde oder auch eine Mutante die konstitutive Phosphorylierung imitiert zeigen verminderte Affinität für Taxol- stabilisierte Mikrotubuli.
Meine Experimente demonstrieren, dass für die MT – Bindungsaktivität von Bim1 sowohl die Dimerisierung des Moleküls als auch das Vorhandensein der N-terminalen Calponin Homo-logie (CH) - Domäne Grundvoraussetzungen sind. Darüber hinaus haben die flexible Linkerregion im Molekül und die CH-Domäne eine synergistische Wirkung auf die MT- Bindungaktivität von Bim1, die durch Phosphorylierung reguliert wird.
Zusätzlich habe ich die Interaktion zwischen Bim1 und dynamischen Mikrotubuli mit total internal reflection fluorescence (TIRF) - Mikroskopie in vitro rekonstruiert. Bim1-Dimere lokali-sieren autonom an das Plus-Ende der Mikrotubuli. Weiters haben die TIRF - Experimente ge-zeigt, dass die Assoziation von Bim1 mit dynamischen Mikrotubuli von Ipl1 reguliert wird.
Um die Rolle Bim1-abhängiger Rekrutierung von Ipl1 an das Plus-Ende der Mikrotubuli im Detail zu studieren, habe ich Ipl1-Mutanten hergestellt die ihre Fähigkeit an Bim1 zu binden ver-loren haben. Eine Serie an Experimenten zeigt, dass die physische Interaktion zwischen Ipl1 und Bim1 notwendig ist für die effiziente Lokalisation von Ipl1 an Mikrotubuli in vitro und die Kinase-Aktivität von Ipl1 in vivo beeinflusst. Zusammenfassend zeigen meine Daten, dass die Linkerdomäne von Bim1 eine wichtige Rolle spielt bezüglich den MT-Bindungseigenschaften des Proteins, und der Fähigkeit das Plus-Ende eines Mikrotubulus zu erkennen. Hieraus ergibt sich ein generelles und ein mögliches Konzept für die Funktion und Regulierung von CH-Domänen in einem EB1-Protein.Dynamic instability of microtubules (MTs) is regulated by several MT-associated proteins. A special subgroup of MT-associated factors is constituted by the plus-end tracking proteins (+TIPs), which are characterized by their selective association with the growing ends of tubulin polymers thus linking cellular components to MT plus ends. +TIPs are highly conserved and among them, EB1 (end binding) proteins have emerged as key regulators of microtubules in all eukaryotes. Despite their widespread importance, molecular mechanisms regulating the activity of these proteins still remain unclear.
Here, I performed a comprehensive structure-function analysis of the budding yeast EB1 protein Bim1p. My study shows that Bim1p is regulated by Aurora B/Ipl1 phosphorylation. Bim1p directly associates with the Ipl1p kinase and upon activation by Sli15p, becomes phosphorylated on a cluster of six serine residues in the flexible linker domain. Bim1p phosphorylation occurs during anaphase in vivo, and it is required for normal spindle elongation kinetics and an efficient disassembly of the spindle midzone. Recombinant Bim1p phosphorylated with Ipl1p-Sli15p complex in vitro or a mutant mimicking constitutive phosphorylation display reduced affinity for taxol-stabilized microtubules.
By engineering different Bim1 mutants I could furthermore demonstrate that the MT binding activity of the molecule depends on the dimerization properties of EB1 and that the N-terminal calponin homology (CH) domain of Bim1p is necessary, but not sufficient for stable microtubule association. In contrast, the flexible linker region of the Bim1 molecule synergistically with the CH domain enhances Bim1p MT binding and is critical for the regulation of this EB1 family member.
By using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF) I could visualize dynamic microtubules in vitro and show that Bim1p, like other EB1-proteins, tracks microtubule plus ends autonomously. My data show that the interaction between Bim1p and dynamic microtubules de-pends on the dimeric form of molecule and that these associations are negatively regulated by Ipl1p phosphorylation of the linker domain.
Finally, I dissected the interaction between the Ipl1 kinase and Bim1p, which is critical for proper kinase function in vivo. I identified two functionally redundant SxIP motifs in the N-terminus of Ipl1p, which mediate the association with the Bim1 EBH domain. The interaction between Bim1p and Ipl1p is negatively regulated by Cdk1 phosphorylation on serine residues immediately adjacent to the SxIP motifs. This suggests a role for Bim1p-mediated translocation of the kinase to the spindle during anaphase
