Il melanoma metastatico è una neoplasia che origina dalla trasformazione maligna dei melanociti presenti nello strato basale dell’epidermide. Nella sua fase più avanzata (Fase IV), tale patologia è spesso associata ad una prognosi infausta e l’aspettativa di vita dei pazienti si riduce a soli 6 mesi.
La melanomagenesi è un complesso fenomeno in cui fattori ambientali si intrecciano ad alterazioni genetiche e/o epigenetiche a carico di geni coinvolti nel controllo di importanti processi cellulari. Nel melanoma si osserva frequentemente la presenza di mutazioni a carico del pathway delle MAP chinasi, un’essenziale via di trasduzione del segnale addetta alla regolazione della proliferazione e della sopravvivenza cellulare. La mutazione più comunemente osservata (50-60% dei melanomi) si ritrova a carico della proteina BRAF e consiste in una mutazione puntiforme che determina la sostituzione della valina in posizione 600 con un residuo di acido glutammico (BRAFV600E). La proteina mutata, essendo costitutivamente attiva, causa un’iperattivazione del pathway, favorendo così lo sviluppo del tumore.
Per lungo tempo si è pensato che la causa della tumorigenesi fossero solo le alterazioni a carico di proteine che controllano l’omeostasi cellulare. Tuttavia, studi recenti hanno posto in evidenza l’importante ruolo svolto dai non-coding RNA, proponendo un loro coinvolgimento nei diversi stadi della trasformazione maligna, come l’iniziazione, la progressione e la metastatizzazione. La nostra attenzione si è in particolar modo focalizzata sui microRNA (miRNA), che costituiscono una famiglia di piccoli RNA non codificanti (21-25 nucleotidi) in grado di regolare l’espressione genica a livello post-trascrizionale. I microRNA sono implicati nei più importanti processi biologici cellulari, quali il controllo del ciclo cellulare, l’apoptosi, il metabolismo, lo sviluppo e il differenziamento.
Nel contesto del melanoma, sono riportati in letteratura solo pochi esempi di non-coding RNA direttamente regolati da BRAFV600E, attraverso il pathway delle MAPK. Quindi, al fine di approfondire la conoscenza relativa al funzionamento di una chinasi che svolge un così importante ruolo nel melanoma umano, si è ricorso all’utilizzo del Deep Sequencing: identificando i miRNA indotti o repressi dal vemurafenib (BRAFV600E-inhibitor) nella linea parentale A375 ma non in un clone resistente, è stato possibile individuare l’intero spettro dei microRNA che sono regolati da BRAFV600E per mezzo del pathway MAPK. Il miR-204-5p (miR-204) è risultato il top-scoring tra i miRNA indotti. Questo microRNA si trova nella stessa famiglia (miR-204 family) del miR-211-5p (miR-211), che non è però espresso nelle A375. Entrambi i miRNA sono intronici: nello specifico, si trovano nell’introne 6 del gene TRPM1 (miR-211) e del gene TRPM3 (miR-204), e sono co-espressi con i loro geni host.
Il mio lavoro di tesi si è concentrato sullo studio della regolazione trascrizionale del miR-204. Per prima cosa ho confrontato il comportamento del miR-204 con quello del miR-211. Entrambi i microRNA sono risultati indotti dal vemurafenib, ma con un andamento diverso. In particolare, ho osservato che il miR-204/TRPM3 è dotato di un’espressione basale in tutte le linee, ma viene indotto dal vemurafenib solo nelle linee amelanotiche (A375, SK-Mel-28 e WM278) e non in quelle melanotiche (501Mel, SK-Mel-5 e WM35). Al contrario, il miR-211/TRPM1 non è sempre espresso, ma, quando presente (nelle linee melanotiche), è sempre indotto dal vemurafenib. Queste evidenze mi hanno suggerito che, a valle del pathway delle MAPK, la regolazione trascrizionale del miR-204 è diversa da quella del miR-211. In effetti, sebbene sia noto in letteratura che il miR-211 e il suo host gene TRPM1 sono target trascrizionali di MITF (Microphthalmia-Associated Transcription Factor), non ho trovato alcuna correlazione tra i livelli di MITF e i livelli di TRPM3/miR-204. Inoltre, ho ottenuto che uno short interfering RNA contro MITF (si-MITF) non è in grado di prevenire l’induzione del miR-204 causata dal vemurafenib. Una volta scartato MITF, si è cercato un altro possibile candidato. La nostra attenzione si è posata su STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) e l’utilizzo di un inibitore specifico, S3I-201, mi ha permesso di stabilire che esso funziona da attivatore trascrizionale del miR-204.
Oltre al MAPK pathway, ci sono altre vie di trasduzione del segnale che convergono su STAT3: ERK pathway, SRC chinasi pathway, JAK/STAT pathway e PI3K/AKT/mTOR pathway. Al fine di comprendere se e come queste vie di segnalazione vadano ad influenzare l’induzione del miR-204, si è ricorso all’utilizzo di numerosi inibitori specifici. Ho dunque valutato se l’induzione del miR-204/TRPM3 vemurafenib-dipendente possa essere contrastata dal concomitante trattamento con un inibitore di JAK2, di SRC o di PI3K, che sono a loro volta noti attivatori di STAT3. I risultati ottenuti mostrano che il duplice inibitore di JAK2/STAT3, WP1066, è in grado di impedire l’attivazione di STAT3 e l’induzione del miR-204, mentre l’inibitore specifico di JAK2 (AZD1480), di SRC (PP1) e di PI3K (Wortmannin) non lo sono. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che, a valle del pathway delle MAPK, l’attivazione di STAT3 non necessita dei pathway JAK, SRC e PI3K/AKT/mTOR.
Al fine di consolidare a livello cellulare i dati relativi alla regolazione trascrizionale del miR-204 ottenuti a livello molecolare, siamo ricorsi all’utilizzo di un sensore. Tale sistema è dotato di un promotore bidirezionale Tet-inducibile che regola l’espressione di due proteine fluorescenti, la mCherry e la eYFP. Ho dunque ingegnerizzato mCherry, inserendo a valle del suo STOP codon una sequenza “Scrambled” di controllo (Sensor SCR) o un miR-204 binding-site (Sensor 204), cioè una sequenza nucleotidica perfettamente complementare a quella del miRNA endogeno maturo. L’interazione del miRNA con il suo sito di legame determina la degradazione del mRNA della mCherry e quindi, una riduzione della sua fluorescenza. Questo significa che esiste una relazione inversa tra i livelli di fluorescenza di mCherry ed i livelli intracellulari di miR-204. Ho dunque ottenuto delle popolazioni clonali che esprimono stabilmente tali sensori. Una volta valutata la corretta funzionalità del sistema tramite l’overespressione del miR-204 sotto forma di si-miRNA, ho confermato i dati molecolari relativi alla regolazione trascrizionale del miR-204 per mezzo di analisi al FACS. Infatti, a seguito del trattamento delle popolazioni clonali con il vemurafenib, ho ottenuto un abbassamento dei livelli di fluorescenza relativi a mCherry, mentre quelli di eYFP restano costanti. Tuttavia, il trattamento combinato con lo STAT3-inhibitor S3I-201, poiché impedisce l’induzione del microRNA, determina un rescue della fluorescenza.
Tra i propositi futuri, c’è l’idea di utilizzare il Sensor 204 per separare popolazioni cellulari dotate di elevati e bassi livelli di miR-204 endogeno (High and Low miR-204 Populations) sfruttando la tecnologia del Cell Sorter, e di svolgere poi delle analisi funzionali che forniscano ulteriori informazioni sul ruolo biologico di questo microRNA, soprattutto nel contesto della farmaco-resistenza al vemurafenib
