Nanomecánica del celulosoma. Implicaciones para la actividad del sistema

Abstract

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 05-02-2016Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 05-02-2017Cellulose is the major biopolymer and carbon source on the biosphere. It is composed of glucose, a sugar that can be processed by several microorganisms to produce added-value chemicals such as biofuels. The major bottleneck towards its utilization in industry is the saccharification step, i. e. the breakdown of the polymer to release the constituent soluble sugars. In nature, this process is carried out by several microorganisms with specialized enzymatic machinery. In particular, some anaerobic bacteria have developed a high molecular weight complex known as the cellulosome. This comprises a large usually non-catalytic protein called scaffoldin, capable of docking several enzymes and targeting them to the cellulosic substrate while binding it to the cell surface. As an adhesion system, we expect that the cellulosome is subjected to mechanical stress since the relative movement of the cell and its substrate would stretch the connecting region: the portion of the scaffoldin located between the two anchoring points. We hypothesized that the mechanical stability, i. e. the resistance to forced unfolding, of this region might be important to understand cellulosome activity since the unfolding of cohesins, which are the scaffoldin modules capable of binding enzymes, might result in enzyme release and activity loss. We have used atomic force microscopy-based single molecule force spectroscopy in combination with molecular dynamics simulations to study the mechanical properties of several cohesins from different cellulosomes. We found that those cohesins located in the connecting region of scaffoldins that bind enzymes are more mechanically stable than those located outside the two anchoring points, in the external region. This principle applies for cohesins of different cellulosomes despite the sequence difference of these modules. We also study the effects of both the linker sequences located between cohesins and enzyme binding on the mechanical stability of cohesins which are elements that are found in natural cellulosomes. We did not observe any effect on cohesin mechanical stability nor on their mechanical clamp positionLa celulosa es el biopolímero y la fuente de carbono más abundante de la biosfera. Está compuesta por glucosa, un azúcar que puede ser procesado por microorganismos para producir productos químicos con valor añadido como los biocombustibles. El mayor cuello de botella para su utilización industrial se encuentra en el paso de la sacarificación, es decir, la degradación de este polímero para liberar los azúcares solubles constituyentes. En la naturaleza este proceso lo llevan a cabo algunos microorganismos que presentan una maquinaria enzimática especializada. En particular, algunas bacterias anaerobias han desarrollado un complejo conocido como celulosoma que comprende una proteína de elevado peso molecular y generalmente no catalítica llamada escafoldina, capaz de unir varias enzimas y dirigirlas al sustrato a la vez que las ancla a la superficie celular. Por el hecho de tratarse de un sistema de adhesión, es de esperar que el celulosoma esté sometido a estrés mecánico dado que el movimiento relativo de la bacteria respecto al sustrato podría estirar la región conectora: la porción de la escafoldina que se encuentra entre los dos puntos de anclaje. Propusimos la hipótesis de que la estabilidad mecánica, es decir, la resistencia al desplegamiento por fuerza, de esta región puede ser importante para entender la actividad del celulosoma. Esto es debido a que el desplegamiento de las cohesinas, los módulos de la escafoldina capaces de unir enzimas, podría conducir a una pérdida de actividad. Hemos empleado espectroscopia de fuerza de moléculas individuales mediante microscopía de fuerza atómica en combinación con simulaciones de dinámica molecular para estudiar las propiedades mecánicas de varios módulos cohesina de distintos celulosomas. Hemos observado que las cohesinas situadas en la región conectora presentan una mayor estabilidad mecánica comparada con la de aquellas que no se espera que estén sometidas a estrés mecánico. Este principio es aplicable a las cohesinas de distintos celulosomas a pesar de las diferencias de secuencia entre ellas. También hemos estudiado el efecto de las secuencias intermodulares y de la unión a enzimas sobre la estabilidad mecánica de las cohesinas, que son elementos que se encuentran en los celulosomas naturales. Hemos visto que ni la estabilidad mecánica de las cohesinas ni la posición de su parche mecánico se ven afectados por estos factore