Thesis--University of Tsukuba, D.Agr.(A), no. 696, 1989. 7.3

Zong Ning

宗 寧

Tsukuba Repository

Studies on [aipha]-D-Xylosidase from bacillus
sp.
著者 Zong Ning
内容記述 Thesis--University of Tsukuba, D.Agr.(A), no.
696, 1989. 7.31
発行年 1989
URL http://hdl.handle.net/2241/3677
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　141
　　　　　　　　　　　そう　　　　　　　　　　ねい氏名（本籍）宗　寧（申国）
学位の種類農学博士学位記番号　博甲第696号
学位授与年月日　　平成元年7月31日
学位授与年月日　　平成元年7月31日
学位授与の要件　　学位規則第5条第1項該当
審査研究科　農学研究科
学位論文題目　　S竜滅…繊α一D－Xyl・・曲・出㈱遷㏄〃…醇．
　　　　　　　　　　　（綴菌の生産するα一D－Xy童⑪s這ぬs㊧に関する研究）
主査　筑波大学教授　　農学博士　安　井　恒　男
副査筑波大学教授　　理学博士新　井　勇　治
副査　筑波大学助教授　農学博士　日下部　　功
副　査　　筑波大学教授　　　農学博士　　大　　庭　　喜八郎
論　　文　　の　　要　　旨
　天然に存在するXy1oSeを含むオリゴ糖，多糖はその殆んどがβ一XyloSy1結合である事と関連し，
β一D－xy1狐aseとβ一D－xy1osidaseについては以前よりかなりの研究がなされている。一方α一
xy1osy1結合はta㎜a．indを始めとする植物種子多糖に存在している事が知られているが，詳細な研究
例は少なく，このためα一D－xy1osidaseについての研究は殆んど行われていなかった。
　最近になって植物細胞壁の一次構造多糖の構造研究により，一次壁構成成分として，Xy1og1uCanと
呼ばれる多糖が広く存在する事が明らかにされた。このxy1og1・ca・の化学構造は基本的にはβ一（1
→4）一D－g1ucanを主鎖とし，その大部分のg1ucose残基の6位のOHに，α一D－xy1opyranose
残基が結合している構造を持つ一種のCe11u1oSe天然誘導体とみなされている。
　また，植物の病害抵抗性についての研究を通じて，生理活性をもつXy1og1uCan由来のオリゴ糖も
発見されている。
　以上のようなα結合Xy1OSeの普通的存在とα結合Xy1oSeを含む生理活性オリゴ糖の発見とあい
まって，1985年にα一D－xy1osidaseの研究が始められ，東北大学の松田和雄教授らの研究グループ
によって始めて微生物（λ∫μ概吻”畑γ）の生産するα一D－xy1osidaseの生産，精製及びその性質
についての報告が出された。
　このα一D一。y1osidaseはα一。y1osy1残基を含む多糖，オリゴ糖の構造解析に，あるいは生理活
性を持つオリゴ糖の調整に利用できるものと考えられる。
　この論文はα一D－xy1oside結合を含む基質の調製から，α一D－xylosidaseを生産する微生物の
検索，分離菌の菌学的研究，酵素生産条件の検討，酵素の精製，その酵素の蛋白化学的・酵素化学
一11一
的一性質の検討を含む一連の研究に関するものである。
　第一章ではα一D－xy1oside結合を持つ基質の調製について述べられている。玉nducerとして使用
した㎜ethy1及びisopropy1α一D－xy1osideは化学的に合成され，またα結合のxy1obioseはxy1ose
の酸逆重合反応により合成し，炭末カラム，棚酸塩一炭末カラム，調製用HPLC及びシリカゲルク
ロマトグラフィーを含む一連のクロマトグラフィーにより3種（α一1．2，α一1．3，及びα一1．4）
のα一xylobioseを分離，精製した。他方，ta㎜a・ind種子多糖（xy1og1ucan）の酵素による部分水解
により，α一（1→6）一xy1oside結合を含むオリゴ糖の調製を行った。部分水解物の一連のクロマ
トグラフィーにより，3種類のヘテロオリゴ糖（D．P．2～4），即ちO一α一D－xy1opyranosy1
一（1→6）一D－91ucopyranose（TXG－2），　O一α一D－xy1opyranosy1一（1→6）一〇一β一
D－g1ucopyranosy1一（1→4）一D－g1ucopyranose（TXG－3），及びO一α一D－xy1opyranosy1
一（1→6）一〇一β一D－g玉ucopyranosyI一（1→4）一〔O一α一D－xyIopyranosy1一（1→6）〕
一D－91㏄opyranose（TXG－4）が得られた。
　第2章ではα一D－xy1osidase生産菌の検索，分離された細菌の菌学的研究及び酵素の生産至適条
件の検討等が述べられている。グルコースオキシダーゼを利用した新しい検索法を考案し，自然界
よりスクリーニングを行い，α一D－xy1osidaseを生産するBα6伽8属細菌2菌株を得た。両菌株と
も通性嫌気性，グラム陰性中温性であり，胞子形成能を持っていた。菌株No208－918－1のGC含量
は50．8mo1％であり，No693－1のGC含量は44．5㎜o1％であった。両菌株とも既知のBα6伽∫種とは
性質を異にしており，新種と推定された。このうちNo693－1株をα一D－xy1osidase生産菌として
取上げ，酵素生産条件について検討した。この酵素は㎜ethy1α一D－xy1oside等により誘導される
誘導酵素で，g1ucose1．O％，peptone1．O％，methy1α一D－xy1oside1．O％，CaClガ2H200．2％等
を含む培地で振とう培養する事によりよく生産された。
　第3章では酵素の精製について述べられている。硫安分画，DEAE－Toyo　pear1650カラムクロマ
トグラフィー，その再クロマトグラフイー及びハイドロオキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
等を行い精製した。精製された標品はDisc電気泳動及びSDS－Disc一電気泳動で均一であった。
　第4章では精製酵素の物理化学的及び酵素化学的性質の検討結果が述べられている。本酵素は
SDS－Disc　ge1電気泳動でsub㎜itの分子量は82，OOO，Toyopead　HW－60を用いたge1炉過の結果算
出された分子量は400，OOOであった。等電点は4．3，酵素活性は45℃に至適温度が認められ，O～50℃
で15分間は安定であった。至適pHは715であり，pH5．O～9．Oで安定であった。酵素活性はZn2＋，
Cu2＋，及びHg2＋イオンにより強く阻害されグCMB及びモノヨード酢酸でも強く阻害された。この
事から本酵素はSH酵素と推定された。λ軌〃敏γ起源のα一D－xy1osidaseと比較し，λ班〃伽γの
酵素より，阻害剤および金属の影響を受けやすい事が明らかとなった。基質特異性については，本
酵素はα一D－xy1opyranosy1結合に特異的でグnitrophe町1α一D－xy1opyranoside，methy1α一D
一。y1opyramside等を分解したが，α一D－xyloside以外のg1ycosidesに対する活性は全く検出され
なかった。Xy1obiose間の分解速度の比較ではα一1．4＞α一1．2＞α一1．3の順で分解した。Ta狐ar－
ind種子多糖由来のisop．i腋everose（TXG－2），62一α一xy1osy1ce11obiose（TXG－3）及び61一
一12一
α一xy1osy1　62一α一xy1osy1cenobiose（TXG－4）についてはTXG－2＞TXG－3＞TXG－4の
速度の順で分解し，xy1oseの遊離が見られた。クーnitrophe町1xy1oside及びisopri㎜everoseに対する
K肌値は1．O㎜M及び55，6㎜M，V㎜axはO．15μ㎜ol／㎜in／㎜g－protein及び2．22μ㎜ol／㎜in／㎜g－pro－
tei。であった。また加水分解により生成するxy1oseのアノマー型はαであった。Ta㎜a．i．d種子多糖
由来の低分子可溶性画分に作用しXy1OSeを遊離したが，その高分子可溶性画分には全く作用しなかっ
たことから，この酵素は低分子基質に作用しやすい傾向があると推定された。
　第5章では糖転移作用について述べられている。本酵素はO．7％isop．imeveroseを用いた時には完
全にxy1oseとg1ucoseとに分解したが，5％基質濃度の場合には，糖転移反応が認められた。生成し
た主な転移反応物を炭末クロマトグラフィーで分離し，更にシリカゲルクロマトグラフィーで精製
する事によってTLCで単一な標晶が得られた。得られた標品について構成糖分析，平均重合度及び
旋先度の測定，メチル化分析等を行うことによりその構造をO一α一D－Xylopyrancsy1一（1→4）
＿O一α＿D－xy1opyranosy1一（1→6）一D－g1ucopyranoseと同定した。
審　　査　　の　　要　　旨
　これまでα一D－xy1osidaseの研究は殆んど行われておらず，細菌のα一xy1osidaseについては全
く新しい事実であり，本論文の内容は酵素化学的に見て重要と思われる。申請者は基質のα一XylO－
sideを合成しているが，この中には純粋な状態で始めて単離されたものも含まれている。また新し
いα一xy1osidase生産菌のスクリーニング法を考案し，その方法を用いて自然界よりα1ylosidase
生産性細菌を分離するなど独創性がある。申請者は基質の調製から始め，酵素生産菌の分離を行い，
該菌の菌学的性質の研究，更に酵素生産条件の検討をなし，生産された酵素を精製してその蛋白化
学的・酵素化学的研究を行うなど，一連の酵素化学研究法を習得しており，今後酵素化学の研究者
として十分やってゆけるものと考えられる。申請者も述べている如く，応用面として本酵素は糖類
の構造研究の手段として利用する事ができ，また生理活性オリゴ糖の調製にも活用されるものと期
待される。
　よって，著者は農学博士の学位を受けるに十分な資格を有するものと認める。
一13一


Studies on [aipha]-D-Xylosidase from bacillus sp.

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Tsukuba Repository