A study on the biological safety of sodium butyrate containing calcium sulfate bone graft

Abstract

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 치과대학 치의과학과, 2024. 2. 양형철.Histone deacetylase inhibitor인 sodium butyrate (SB)는 조골세포의 골형성분화를 촉진하고, calcium sulfate (CS)에 혼합된 형태로 동물모델에서 골형성을 촉진한다. 특히 SB/CS 혼합물의 뛰어난 골형성 촉진효과로 향후 임상적 적용이 기대된다. 따라서 SB/CS에 대한 충분한 생물학적 안전성 검토에 대한 필요성이 높다. 또한 SB는 현재까지 의약품으로 사용된 바가 없어 SB 단독으로도 안전성 연구가 수행되어야 한다. 이러한 맥락에서 본 연구에서는 SB에 대한 반복투여독성시험을 통해 SB의 안전성을 일부 입증하고자 하였으며, SB/CS 혼합물에 대해서는 전신적 독성에 해당되는 유전독성, 감작성, 급성독성 시험을 수행하였다. SB의 rat에 대한 반복투여독성은 고농도 (2 mg/mL)에서도 시험 중 동물의 사망이나 임상증상 이상이 나타나지 않았다. 혈액응고시험에서는 수컷에서 유의한 증가와 감소가 나타났으나, 이의 변화가 일관적이지 않고, 현저한 증감이 아니므로 혈액응고에 대한 SB의 영향은 크지 않다고 할 수 있다. 혈액생화학적 분석 결과, 수컷의 경우 고용량투여군에서 total protein이 유의하게 감소, 암컷의 경우 중용량/고용량투여군에서 urea nitrogen, total protein, total bilirubin, creatinine, A/G ratio, calcium이 유의하게 감소 또는 증가하였으나, 이러한 변화들은 용량에 의존적이지 않으며 기존 참고치 내에서의 변화였으며, 조직학적 변화 양상을 고려하여 볼 때 독성학적 의미를 갖지 않는 것으로 판단된다. 장기의 중량 측정 결과, 모든 동물 암 · 수에서 대조군과 비교하여 유의한 증감은 관찰되지 않았다. 부검 시 육안적 이상 병변으로 암 · 수 대조군 및 시험물질투여군에서 폐와 흉선의 부분적 변색, 중용량투여군에서 림프절 비대, 고용량투여군에서 음핵샘 spot이 관찰되었다. 조직병리학적 관찰 결과, 부검 시 관찰된 육안 병변의 경우 특이소견이 관찰되지 않았으며, 일부 개체에서 관찰된 국소적 염증 병변 및 신장 석회화는 대조군에서도 관찰되었고, 시험물질투여군에서 더 심한 양상을 보이지 않았기 때문에 환경이나 rat 개체 간 특성에 의한 것으로 판단된다. 암컷 고용량투여군 일부에서 관찰된 지방간 소견도 그 정도가 미약하였고, 한 개체에서만 보였기 때문에 투여물질에 의한 것이 아니라 개체 특이성 때문으로 판단된다. 결론적으로 SB를 SD rat에 정맥 내로 4주 간 반복 적용한 결과, 본 시험 조건 하에서 SB의 무독성량 (NOAEL)은 10㎎/㎏ B.W.으로 판단된다. SB/CS 복합물의 유전독성시험은 Ames test와 소핵시험으로 독성여부를 평가하였으며, 시험 결과 Ames test와 소핵시험 모두 음성대조군과 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 따라서 SB/CS의 유전독성은 없는 것으로 판단된다. SB/CS의 피부 감작성은 극성용매추출액과 비극성용매추출액 모두 음성대조군 보다 높은 SI를 보였으나, 감작성 판단의 기준인 1.6보다 유의하게 낮으므로 감작성이 없는 것으로 보인다. 마지막으로 급성독성시험 결과 SB/CS는 임상적 이상을 보이지 않았고, 정상적인 체중 증가를 보였으므로 급성독성이 없는 것으로 판단된다. 따라서 SB/CS는 아급성독성과 발암성을 제외하고 전신적 위해성은 없는 것으로 판단된다.The histone deacetylase inhibitor sodium butyrate (SB) promotes osteogenic differentiation of bone cells and enhances bone formation in animal models when mixed with calcium sulfate (CS). Particularly, the outstanding osteogenic promotion effect of SB/CS mixture raises expectations for future clinical applications. Therefore, there is a high demand for a comprehensive assessment of the biological safety of SB/CS. Furthermore, since SB has not been used as a pharmaceutical agent to date, safety studies on SB alone are also necessary. In this context, this study aimed to partially establish the safety of SB through repeated-dose toxicity testing and conducted genetic toxicity, sensitization, and acute toxicity tests for SB/CS mixture. The repeated-dose toxicity of SB did not result in animal deaths or clinical abnormalities even at high concentrations (2 mg/mL) during the study. In the blood coagulation test, there were some significant increases and decreases observed in males. However those changes were not consistent, and they were not substantially different, suggesting that SB has a minor impact on blood coagulation. Regarding the results of blood biochemistry tests, in males, the high-dose group showed a significant decrease in total protein. In females, the middle- and high-dose groups exhibited significant decreases or increases in urea nitrogen, total protein, total bilirubin, creatinine, A/G ratio, and calcium. However, these changes were not dose-dependent, and they remained within the reference range. Considering the histological changes observed, these alterations are deemed to be not of toxicological significance. In the organ weight measurements, there were no significant differences observed in both male and female animals when compared to the control group. Upon necropsy, gross pathological findings in both male and female control and test substance-treated groups included partial discoloration of the lungs and thymus, lymph node enlargement in the middle-dose group, and an increase in eosinophilic spots in the high-dose group. Histopathological examination of these observed gross findings did not reveal any specific abnormalities. Localized inflammatory lesions and renal calcification, observed in some individuals during necropsy, were also found in the control group and did not show a more severe pattern in the test substance-treated group, indicating that they were likely due to environmental or individual factors. The minimal findings of hepatic steatosis observed in one female in the high-dose group were minor in severity and seen in only one individual, suggesting that this observation was likely due to individual variability rather than the administration of the test substance. In conclusion, after intravenous administration of SB to SD rats for 4 weeks under the conditions of this study, the No Observed Adverse Effect Level (NOAEL) for SB was determined to be 10 mg/kg B.W. The genetic toxicity testing of SB/CS compound included the Ames test and the micronucleus test to assess its toxicity, and the test results did not show statistically significant differences compared to the negative control group in both the Ames test and micronucleus test. Therefore, it is concluded that SB/CS does not exhibit genetic toxicity. The skin sensitization of SB/CS was evaluated using both polar solvent extracts and non-polar solvent extracts. While both extracts showed higher Stimulation Indices compared to the negative control group, they were significantly lower than the criterion for sensitization judgment, which is 1.6. Therefore, it can be inferred that SB/CS does not have skin sensitization potential. Finally, the acute toxicity testing results for SB/CS showed no clinical abnormalities and demonstrated normal body weight gain, indicating the absence of acute toxicity. Consequently, SB/CS is considered to be non-hazardous systemically, excluding subacute toxicity and carcinogenicity.I. 서론 · 1 1. 경조직 발달과 재생에 대한 histone deacetylase (HDAC)의 영향 1 2. Sodium butyrate의 약리적 효과 및 안전성 3 3. SB를 포함한 calcium sulfate 골이식재의 골형성 효과와 생물학적 안전성 5 II. 재료 및 방법 5 1 . SB 반복투여독성시험 5 2. SB/CS Ames test 7 3. SB/CS 소핵시험 9 4. SB/CS 감작성 시험 (LLNA법) 10 5. SB/CS 급성독성 시험 · 11 III. 결과 12 1 . SB 반복투여독성시험 12 2. SB/CS Ames test 20 3. SB/CS 소핵시험 20 4. SB/CS 감작성 시험 (LLNA법) 21 5. SB/CS 급성독성 시험 22 IV. 고찰 25 V. 결론 27 참고문헌 29 Abstract 34박