Foi estimado as freqüências gênicas para os marcadores RFLP Kapa-caseina e hormônio do crescimento e os microssatélites

COUTINHO, L. L.

FIGUEIREDO, L. G.

PACKER, I. U.

RAZOOK, A. G.

REGITANO, L. C. de A.

ROSA, A. J. de M.

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TESTE DE PATERNIDADE NA RAÇA NELORE POR MEIO DE EXAMEDODNAARTUR J. DE M. ROSA; IRINEU U. PACKER; LUCIANA C. A. REGITANO;ALEXANDER G. RAZOOK; LEOPOLDO G. FIGUEIREDO; LUIZ L. COUTINHOINTRODUÇÃOVários programas de melhoramento genético na raça Nelore empregam a matrizde parentesco dos animais para obter predições do valor genético com propriedades BLUP.Portanto, os erros de identificação de paternidade tem efeito prejudicial sobre as prediçõesdas DEPs e dos parâmetros genéticos. Erros de paternidade podem atingir até 20% dosregistros de animais em diversos países (RON et a!. 1995). As relações de parentesco entreindivíduos podem ser verificadas por meio de várias categorias de marcadores genéticos emoleculares. Os marcadores moleculares microssatélites destacam-se por seremcodominantes, bem distribuídos e alto polimorfismo, características que permitem atingir aprobabilidade de exclusão combinada superior a 0,99 sugerida por GJERTSON et a!.(1988). O teste só pode ser efetuado em animais pertencentes a populações caracterizadaspara os sistemas genéticos que se pretendem utilizar, isso significa que a probabilidade depaternidade é dependente da freqüência gênica dos alelos herdados dos progenitores(BALDING & NICHOLS, 1995).OBJETIVOSO presente trabalho tem por objetivo estimar as freqüências gênicas para osmarcadores RFLP Kapa-caseína (KpCn), p-Iactoglobulina (PLG) e hormônio docrescimento (GH) e os microssatélites IGF I, INRA- 006, CSFM- 50 e BM- 1224,desenvolver um teste de paternidade, analisar a eficiência das diferentes categorias demarcadores moleculares na exclusão de paternidade e avaliar a freqüência de erros deidentificação em alguns rebanhos da raça Nelore.MATERIAL E MÉTODOSO polimorfismo dos marcadores foi avaliado em um a amostra de 63 animais daraça Nelore, não aparentados em primeiro grau, provenientes de 23 rebanhos dentre osparticipantes da "Prova de Ganho de Peso" de 1995 do Instituto de Zootecnia deSertãozinho- SP. O DNA foi extraído a partir de uma amostra de sangue periférico. Osgenótipos foram determinados a partir da amplificação de regiões de interesse do DNAutilizando-se da técnica da PCR e iniciadores descritos por SCHLEE et a!. (1994) paraGH; MEDRANO e CORDOBA (1990a) para KpCn; MEDRANO e CORDOBA (1990b)para pLG; MOORE et a!. (1994) para CSFM- 50; VAlMAN et a!. (1994) para INRA-006; BISHOP et a!. (1994) para BM- 1224; BISHOP et a!. (1994) para IGF I. O fragmentoamplificado de cada RFLP foi digerido com as enzimas de restrição Alu I, HinfI e Hae IIIpara GH, KpCn e pLG, respectivamente. Os RFLP foram detectados em brometo de etídioe os microssatélites por marcação isotópica dos iniciadores 1 com y32 P- ATP. Asfreqüências gênicas e genotípicas foram estimadas por contagem simples. A probabilidadede exclusão e probabilidade de paternidade foram calculadas utilizando as fórmulasdescritas por DO DOS et a!. (1996) e probabilidade de exclusão combinada (PEC) descritapor RON et al. (1995).219RESULTADOS E DISCUSSÃOAs freqüências gênicas obtidas para o alelo I dos marcadores RFLP foram:KpCn 0,91; pLG 0,41 e GH não apresentou polimorfismo de substituição de leucina porvalina. Os microssatélites apresentaram alelos com as seguintes freqüências: IGF r (0,26 e0,74); BM- 1224 (0,01; 0,04;0,46; 0,28; 0,12; 0,08 e 0,08); CSFM- 50 (0,02; 0,27; 0,25;0,15; 0,32) e INRA (0,12; 0,08; 0,02; 0,19; 0,43; 0,09 e 0,12). Os resultados daprobabilidade de exclusão (PE) estão apresentadas no Quadro I. Os valores de PE obtidospara os microssatélites INRA- 006, BM- 1224 e CSFM- 50 foram satisfatórios, o mesmonão pode ser afirmado para o IGF r ou para os RFLP. A PEC, entretanto, esteve aquém doideal (0,99). Ainda assim, a análise dos genótipos de 13 famílias touro/ vaca! progênie,participantes do teste de paternidade, possibilitou a exclusão de paternidade em duasfamílias, sistemas genéticos (BM- 1224, CSFM- 50 e INRA- 006) em uma e um sistema(BM- 1224) na outra, atingindo aproximadamente 15% (2113), semelhante ao obtido emoutros países (RON et aI. 1996). Os resultados do teste de paternidade, descritos noQuadro 2, apresentaram probabilidade de paternidade entre 0,6115 e 0,9987, com média0,8814. somente 3 famílias atingiram os 0,99 recomendados. Se este valor forrepresentativo da raça Nelore evidencia-se a necessidade de um controle mais eficientesobre os registros genealógicos.CONCLUSÕESAs freqüências encontradas para os locos KpCn e pLG são concordantes com osvalores descritos na literatura, sugerindo que a amostra é representativa da raça Nelore. Osmicrossatélites CSFM- 50, BM- 1224 e o INRA- 006 apresentaram polimorfismosatisfatório e conseqüentemente probabilidade de exclusão (PE) adequados para seproceder a um teste paternidade. O mesmo não ocorreu para os marcadores RFLP KpCn,GH, pLG e o microssatélite IGF I.O valor de 0,9089 para a PEC (probabilidade de exclusão combinada) foi menordo que 0,99, valor este recomendado para fins de teste de paternidade. Portanto outrosmarcadores microssatélite devem ser adicionados para se atingir a PE pretendida. Outrastécnicas de análise, por exemplo, PCR- multiplex, são necessárias para aumentar a rapidezdo teste.O erro de identificação próxima a 15% obtida neste trabalho justifica o uso doteste de paternidade em programas de melhoramento genético em várias situações práticas:I) Em uma porcentagem dos animais registrados a cada ano na associação, para verificar avalidade e consistência das informações fornecidas pelos criadores; 2) Nos programas deavaliação de touros jovens objetivando a predição do valor genético 3) Na identificação dapaternidade de animais gerados com a técnica reprodutores múltiplos.A amostragem deverá ser ampliada para caracterizar as diferentes linhagensfamiliares existentes na raça e melhorar a confiabilidade do teste de paternidade uma vezque os animais seriam testados de acordo com as freqüências alélicas da linhagem familiara qual pertencem.220QUADRO 1- Probabilidade de exclusão (PE) para cada marcador genético e proba!:de exclusão combinada (PEC) oara todos os marcadores.Marcador I KpCn pLG GH IGF I CSFM-500,156 0,508 0,441BM-1224INRA-0060,073 0,176 °PE 0,521QUADRO 2: Probabilidade de ara cada família.Família I 1 2 3PP 0.9944 0,9818 0,93686 7 8 9 100,9987 0,9224 0,6115 0,6985 0.9309REFERÊNCIAS BmLIOGRÁFlcASBALDING, D. J.; NICHOLS, R. A. A method for quantifying differentiation bpopulations at multi-allelic loci and its implications for investigating identipatemity. Genética, v. 96, p. 3-12, 1995.BISHOP, M. D.; KAPPES, S. M.; KEELE, 1. W. et aI. A genetic linkage map forGenetics, v. 136, p. 619-639, 1994,DODDS, K G.; TATE, M. L.; MCEWAN, 1. C, et al. Exclusion probabilities for pctesting farm animais. Theoretical and Applied Genetics, v. 92, p. 966-975, 19'GJERTSON, D. W.; MICKEY, M. R.; HOPFIELD, 1. et al. Calculation of probabpaternity using DNA sequences. American Journal of Human Genetics, v.860-869, 1988.MEDRANO, 1. F.; CORDOBA, E. A. Genotyping of bovine kappa-casein loei foIDNA sequence amplification. Biotechnology, v. 8, p. 144-146, 1990a.MEDRANO, 1. F.; CORDOBA, E. A. Polymerase chain reaction amplification ofp-lactoglobulin genomics sequences and identificatoin of genetics variants byanalysis. Animal Biotechnology, v. I, p. 73-77, 1990b,MOORE, S. S.; BYRNE, K; BERGER, K, T. et al., Characterization of 65microsatellite. Mammalian Genome, v. 5, p. 84-90, 1994.RON, M.; BLANC, V,; BAND, M, et al, Misidentification rate in the lsraeli dairjpopulation and its implications for genetic improvement. Journal of Dairy S,v, 79, p. 676-681, 1995.SCHLEE, P.; GRAML, R.; SCHALENBERGER, E. et al. Growth hormone and inlike growth factor I concentrations in bulls of various growth hormone genTheoretical and Applied Genetics, v. 88, p. 497-500, 1994.VAlMAN, D.; MERCIER, D.; MOAZAMI-GOUDARZI, K. et al. A set of 9Smicrosatéllite: characterization, synteny mapping and polymorphism. MannGenome, v. 5, p. 288-297, 1994.221RESULTADOS E DISCUSSÃOAs freqüências gênicas obtidas para o alelo 1 dos marcadores RFLP foram:KpCn 0,91; pLG 0,41 e GH não apresentou polimorfismo de substituição de leucina porvalina. Os microssatélites apresentaram alelos com as seguintes freqüências: IGF I (0,26 e0,74); BM- 1224 (0,01; 0,04;0,46; 0,28; 0,12; 0,08 e 0,08); CSFM- 50 (0,02; 0,27; 0,25;0,15; 0,32) e INRA (0,12; 0,08; 0,02; 0,19; 0,43; 0,09 e 0,12). Os resultados daprobabilidade de exclusão (PE) estão apresentadas no Quadro I. Os valores de PE obtidospara os microssatélites INRA- 006, BM- 1224 e CSFM- 50 foram satisfatórios, o mesmonão pode ser afirmado para o IGF I ou para os RFLP. A PEC, entretanto, esteve aquém doideal (0,99). Ainda assim, a análise dos genótipos de 13 famílias touro/ vaca! progênie,participantes do teste de paternidade, possibilitou a exclusão de paternidade em duasfamílias, sistemas genéticos (BM- 1224, CSFM- 50 e fNRA- 006) em uma e um sistema(BM- 1224) na outra, atingindo aproximadamente 15% (2/13), semelhante ao obtido emoutros países (RON et a!. 1996). Os resultados do teste de paternidade, descritos noQuadro 2, apresentaram probabilidade de paternidade entre 0,6115 e 0,9987, com média0,8814. somente 3 famílias atingiram os 0,99 recomendados. Se este valor forrepresentativo da raça Nelore evidencia-se a necessidade de um controle mais eficientesobre os registros genealógicos.CONCLUSÕESAs freqüências encontradas para os locos KpCn e pLG são concordantes com osvalores descritos na literatura, sugerindo que a amostra é representativa da raça Nelore. Osmicrossatélites CSFM- 50, BM- 1224 e o INRA- 006 apresentaram polimorfismosatisfatório e conseqüentemente probabilidade de exclusão (PE) adequados para seproceder a um teste paternidade. O mesmo não ocorreu para os marcadores RFLP KpCn,GH, pLG e o microssatélite IGF I.O valor de 0,9089 para a PEC (probabilidade de exclusão combinada) foi menordo que 0,99, valor este recomendado para fins de teste de paternidade. Portanto outrosmarcadores microssatélite devem ser adicionados para se atingir a PE pretendida. Outrastécnicas de análise, por exemplo, PCR- muItiplex, são necessárias para aumentar a rapidezdo teste.O erro de identificação próxima a 15% obtida neste trabalho justifica o uso doteste de paternidade em programas de melhoramento genético em várias situações práticas:1) Em uma porcentagem dos animais registrados a cada ano na associação, para verificar avalidade e consistência das informações fornecidas pelos criadores; 2) Nos programas deavaliação de touros jovens objetivando a predição do valor genético 3) Na identificação dapaternidade de animais gerados com a técnica reprodutores múltiplos.A amostragem deverá ser ampliada para caracterizar as diferentes linhagensfamiliares existentes na raça e melhorar a confiabilidade do teste de paternidade uma vezque os animais seriam testados de acordo com as freqüências alélicas da linhagem familiara qual pertencem.220QUADRO 1- Probabilidade de exclusão (PE) para cada marcador genético e probabilidadede exclusão combinada PEC ara todos os marcadores.INRA-006PECBM-1224Marcador KpCn pLG GH IGFI CSFM-500,156 0,508 0,441 0,521 0,9010,073 0,176 °PEara cada família.QUADRO 2: Probabilidade de atem idade (PP100.930990,6985110,88236780,9987 0,9224 0,6115Família 1 2 3 4 5PP 0,9944 0,9818 0,9368 0,7478 0,9906REFERÊNCIAS BffiLIOGRÁFICASBALDING D. J: NICHOLS, R. A. A method for quantifying differentiation betweenpopulations a; multi-allelic loci and its implications for investigating identity andpaternity. Genética, v. 96, p. 3-12,1995.BlSHOP, M. D.; KAPPES, S. M.; KEELE, J. W. et aI. A genetic linkage map for cattle.Genetics, v. 136, p. 619-639, 1994.DODDS, K. G.; TATE, M. L.; MCEWAN, J. C. et a!. Exclusion probabilities for pedigreetesting farm animaIs. Theoretical and Applied Genetics, v. 92, p. 966-975, 1996.GJERTSON, D. W.; MICKEY, M. R.; HOPFIELD, J. et aI. Calculation of ~robability ofpaternity using DNA sequences. American Journal of Human GenetIcs, v. 43, p.860-869, 1988. .' . fi II .MEDRANO, J. F.; CORDOBA, E. A. Genotyping of bovine kappa-casein 10Cl o owmgDNA sequence amplification. Biotechnology, v. 8, p. 144-1.46, 1990.a.. .MEDRANO, J. F.; CORDOBA, E. A. Polymerase chain reaction a~pl!fic~tlOn of bovinep-Iactoglobulin genomics sequences and identificatoin of genetics vanants by RFLPanalysis. Animal Biotechnology, v. 1, p. 73-77, 1990b. ., .MOORE, S. S.; BYRNE, K.; BERGER., K. T. et aI., Characterization of 65 bovinemicrosatellite. Mammalian Genome, v. 5, p. 84-90, 1994. . .,RON, M.; BLANC, Y.; BAND, M. et a!. Misidentification rate in the Israel!. dalry.cattl~population and its implications for genetic improvement. Journal of Daíry Science,v.79 p. 676-681, 1995. . rSCHLEE' P.: GRAML R.' SCHALENBERGER., E. et aI. Growth hormone and msu me, ., " . wth h genotypesIike growth factor I concentrations in bulls of vanous gro ormoneTbeoretical and Applied Genetics, v. 88, p. 497-500, 1994. f 99 ttlVAIMAN D' MERCIER., D.· MOAZAMI-GOUDARZI, K. et aI. A set o ca. I, ., , . d I h' m Mammaliaimicrosatéllite: characterization, synteny mappmg an po yrnorp lS .Genome, v. 5, p. 288-297, 1994.221

Teste de paternidade na raça Nelore por meio de exame do DNA.

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