FERUCK, M.

LAZAROTO, J.

MORES, N.

OLIVEIRA FILHO, J. X. de

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   74  7ª Jornada de Iniciação Científica - JINC 24 de outubro de 2013  Concórdia,SC PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA PARA Pasteurella multocida EM AMOSTRAS DE PULMÃO DE SUÍNOS  Marilete Feruck1; Juliana Lazaroto2*; Marcos A. Z. Morés3;   João Xavier de Oliveira Filho4 e Nelson Morés3 ¹Graduanda em Ciências Biológicas pela Universidade do Contestado, Campus Concórdia, estagiária da Embrapa Suínos e Aves, e-mail: maari_i@hotmail.com  2Departamento de Pós-Graduação em Ciência Animal, Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC / CAV), Lages, SC 3Embrapa Suínos e Aves 4Departamento de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS   Palavras-chave: imuno-histoquímica, pasteurella multocida, suínos.  INTRODUÇÃO Pasteurella multocida é uma bactéria pertencente à família Pasteurellaceae, cocobacilo Gram-negativo e anaeróbio facultativo (5). É um dos principais agentes envolvidos em processos pneumônicos e pleurisias em suínos, além de participar da etiopatogenia da rinite atrófica progressiva em associação com Bordetella bronchiseptica (2). P. multocida é considerada agente secundário no “complexo de doenças respiratórias dos suínos” (CDRS), sendo comumente encontrada em lesões pulmonares (4), porém também podem atuar como agente primário ocasionando quadro de pneumonia/pleurite/pericardite (3). O diagnóstico presuntivo de pneumonia por P. multocida baseia-se na observação dos sinais clínicos (dispneia e febre) e alterações patológicas (broncopneumonia fibrinossupurativa associada ou não com pleurite e pericardite fibrinosa). Associado aos achados clínico-patológicos, o diagnóstico definitivo é obtido com detecção do agente por cultivo bacteriano e/ou testes moleculares (9). Além dessas técnicas, a imuno-histoquímica (IHQ) pode ser uma ferramenta importante no diagnóstico da doença, por ser um método que permite detectar o agente etiopatológico no local de infecção, em tecidos fixados em formol e incluídos em parafina. Esse estudo teve como objetivo padronizar a técnica de IHQ para detecção de P. multocida para ser utilizada como ferramenta no diagnóstico de casos de pneumonia/pleurisia/pericardite em suínos.  MATERIAIS E MÉTODOS A padronização da IHQ para a marcação da P. multocida foi realizada pelo método de estreptavidina-biotina-peroxidase, utilizando-se um kit comercial (Kit LSAB® + System – HRP da DakoCytomation®). O anticorpo policlonal anti-P. multocida utilizado foi produzido in house em ovinos com um isolado de P. multocida estocado na Bacterioteca (Nº 11246) da Embrapa Suínos e Aves (8). Esse isolado foi obtido de um suíno de terminação com lesões acentuadas de pleuropneumonia fibrino-necro-supurativa, oriundo de granja de ciclo completo com surto grave de doença respiratória. Para a padronização da IHQ foram utilizados tecidos de pulmões de suínos SPF (Specific Pathogens Free) inoculados experimentalmente com o mesmo isolado utilizado na produção do soro hiperimune. A identidade do isolado foi confirmada como P. multocida tipo A por técnicas microbiológicas (6) e moleculares estabelecidas para a espécie (10). Inicialmente as amostras de pulmão foram fixadas em formol 10%, processadas rotineiramente, incluídas em parafina e os tecidos cortados com 3µm de espessura e fixados em lâminas tratadas com poly-L-lisina. Para o teste de IHQ os tecidos foram desparafinados e desidratados, e após submetidos aos seguintes passos: a) Recuperação antigênica pela associação de calor e ação enzimática: as lâminas foram submersas em tampão citrato e levadas ao micro-ondas por 5 min em potência de 700W (2X) e em seguida, os tecidos foram cobertos com a enzima pepsina 0,04%, incubadas em câmara úmida em estufa a 37ºC por 10 min.; b) Bloqueio da peroxidase endógena: as lâminas foram submersas em peróxido de hidrogênio 3% por 5 min.; c) Anticorpo primário: foi aplicado sobre os cortes diluído em solução contendo PBS (Tampão Fostafo-Salino), BSA (Bovine Serum Albumin) e azida sódica, nas diluições de 1:250, 1:500, 1:800 e 1:1200 por 2 horas a 37ºC; d) Anticorpo conjugado de ligação: os cortes histológicos foram incubados com anticorpo secundário biotinilado por 30 min a 37ºC e lavados com solução PBS; e) Revelação da reação: adicionou-se o conjugado estravidina-biotina-peroxidase por 30 min a 37 ºC e a revelação foi realizada com 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) por 5 min a 37ºC; f) A contra coloração foi realizada com hematoxilina de Mayer por 2 min. Entre cada etapa, as lâminas foram enxaguadas por 5 minutos em solução PBS. Para verificar a especificidade da técnica foram utilizados tecidos positivos para os seguintes agentes: Actinobacillus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae sorotipos 3 e 5, Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyopneumoniae e P. multocida tipo D. Além disso, realizou-se testes de    75  7ª Jornada de Iniciação Científica - JINC 24 de outubro de 2013  Concórdia,SC sensibilidade com tecidos inoculados com outras amostras de P. multocida tipo A isoladas de suínos com lesões respiratórias.  RESULTADOS E DISCUSSÃO A técnica de IHQ utilizada mostrou-se eficaz na detecção de antígeno da P. multocida nos tecidos de suínos inoculados. O antígeno foi localizado principalmente no citoplasma de células fagocitárias (macrófagos e neutrófilos) e livres no parênquima alveolar de áreas pulmonares necróticas e no exsudato fibrinossupurativo na pleura, o que demonstra a atuação do agente como causa de pneumonia e pleurite. Na determinação da diluição do anticorpo policlonal de ovino anti-P. multocida tipo A, a diluição de 1:800 apresentou os melhores resultados, mostrando marcação antigênica adequada sem a ocorrência de background. Outros estudos da técnica de IHQ para P. multocida utilizam anticorpo policlonal anti-P. multociada tipo A de coelho na diluição de 1:2000 (1,7) Na análise de especificidade para outros agentes bacterianos causadores de pneumonias em suínos não houve marcação de antígenos nos tecidos inoculados com Actinobacillus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis e Mycoplasma hyopneumoniae, porém houve marcação positiva para P. multocida tipo D, demonstrando que o anticorpo utilizado não diferencia os tipos capsulares A e D. No teste de sensibilidade a técnica mostrou-se eficaz para a identificação de outras amostras de P. multocida isoladas de suínos com doença respiratória.  CONCLUSÃO A técnica de IHQ padronizada permitiu a marcação específica do antígeno de P. multocida em fragmentos de pulmão fixados em formol e incluídos em parafina.   REFERÊNCIAS 1. DAGLEISH, M. P. et al. Characterization and Time Course of Pulmonary Lesions in Calves after Intratracheal Infection with Pasteurella multocida A:3. Journal of Comparative Pathology. Vol. 142, p. 157 -169, 2010. 2. HANSEN, M.S.; PORS, S.E.; JENSEN, H.E.; BILLE-HANSEN, V.; BISGAARD, M.; FLACHS, E.M.; NIELSEN, O.L. An investigation of the Pathology and Pathogens Associated with Porcine Respiratory Disease Complex in Denmark, Journal of Comparative Pathology 2010. 3. KICH, J. D. ; MORES, N. ; TRIQUES, N. ; NOGUEIRA, M. G. ; LOCATELLI, C. ; KLEIN, C. S.; FELICIO, R. P. A Pasteurella multocida tipo A atuaria como agente primário nos processos pneumônicos dos suínos? Comunicado Técnico n. 469, Embrapa Suínos e Aves Concórdia, p. 7 2007. 4. MORES, M. A. Z. Anatomopatologia e bacteriologia de lesões pulmonares responsáveis por condenações de carcaças em suínos. 2006. Curitiba, Dissertação (Mestrado) - Curso de Pós – Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Federal do Paraná. 5. PIJOAN, C. Pneumonic pasteurellosis. In: STRAW, B. E.; ZIMMERMAN, J. J.; D’ALLAIRE, S.; TAYLOR, D. J. Diseases of swine. 9.ed. Ames: Blackwell Publishing, 2006. p.719-726. 6. QUINN, P.J., CARTER, M.E., MARKEY, B., CARTER, G.R., 1998. Clinical Veterinary Microbiology. Mosby-Year Book. 648 p. 1998. 7. ONO, M. et al, Immunohistopathologic Demonstration of Pleuropneumonia Associated with Morganella morganii in a Piglet. Veterinary Pathology Online vol: 38 p. 336–339, 2001. 8. SILVA, G. B.et. al, Produção de soro hiperimune para detecção de Pasteurella multocida. In: 6º JORNADA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E II SEMINÁRIO DE PESQUISA E EXTENSÃO DA UNC, 2012, Concórdia, Anais da VI Jornada de Iniciação Científica (JINC) e do II Seminário Integrado de Pesquisa e Extensão da UnC (SIPEX), Concórdia, 25 de outubro de 2012. – Brasília, DF: Embrapa, p 20, 2012. 9. SOBESTIANSKY, J., BARCELLOS, D. Doenças dos Suínos. Goiânia: Cânone Editorial, 768 p. 2007. 10. TOWNSEND, K.M., BOYCE, J.D., CHUNG, J.Y., FROST, A.J., ADLER, B., 2001. Genetic organization of Pasteurella multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system. J. Clin. Microbiol. Vol: 39 (3), p. 924–929, 2001.       

Padronização da técnica de muno-histoquímica para Pasteurella multocida em amostras de pulmão de suínos.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/973845/1/final7312.pdf

Padronização da técnica de muno-histoquímica para Pasteurella multocida em amostras de pulmão de suínos.

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