DINIZ, L. E. C.

SANTOS, J. M. S. dos

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III Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros 95Isolamento e Clonagem do Promotor Tecido-especifi co Completo e Transformação Genética de Musa spp.Joane Marília Santana dos Santos1; Leandro Eugenio Cardamone Diniz2ResumoBananeira é uma espécie pertencente à família Musaceae típica de regiões tropicaise subtropicais, que apresenta grande importância econômica e social no mundo,uma vez que constitui fonte de renda e alimento para milhões de pessoas, emborao seu cultivo seja afetado por diversos problemas causados por fungos, bactérias,vírus, nematóides e insetos, além de estresses abióticos. Uma das estratégias para a solução dos principais problemas é a obtenção de novas variedades resistentes a doenças, nematóides e insetos mediante programas de melhoramento.As pragas e doenças são responsáveis por severas perdas na produção de banana,que, a depender dos fatores envolvidos, pode ser de até 100%, uma vez que, em muitos casos, não existe nenhuma alternativa de controle. O promotor é umaregião reguladora do DNA localizada upstream da sequência codante do gene, sendo constituído por sequências de nucleotídeos que funcionam como ponto dereconhecimento para a ligação da RNA polimerase, conferindo assim, um pontode controle para a transcrição regulada do gene. Em eucariotos, o início da transcrição depende da ligação ao promotor de um conjunto de proteínas designadasfatores de transcrição. Estes fatores se ligam às sequências promotoras, recrutando a RNA polimerase, a enzima que sintetiza o RNA a partir da regiãocodante do gene. Como os promotores tipicamente são imediatamente adjacentesao gene em questão, a posição dos promotores é designada relativamente ao sítio de inicio da transcrição, onde a transcrição do RNA começa por um gene em particular, ou seja, posições upstream são números negativos iniciando acontagem pelo -1, por exemplo, -100 é a posição 100 pares de bases upstream.Com isso, os objetivos deste trabalho foram isolar e clonar uma região promotorade expressão gênica de caráter tecido-específi co (folha) completo (full-promoter)e iniciar o processo de validação deste promotor através da transformação genética de uma região promotora de expressão gênica em Musa spp.1 Graduanda em Ciências Biológicas da Universidade Tiradentes, Aracaju, SE.2 Biólogo, doutor em Genética e Melhoramento, pesquisador da Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE, leandro.diniz@embrapa.br.III Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros96Palavras-chave: banana, promotor, tecido-específi co, transformação.IntroduçãoA banana (Musa spp.) é uma espécie cultivada em mais de 100 países tropicais e subtropicais. Esta fruteira é o alimento básico na dieta de mais de 400 milhões de pessoas, possuindo um importante papel social e econômico nos países produtores. A banana é uma cultura bastante versátil, capaz de ser cultivada em diferentes ambientes, o que a torna interessante para produção por pequenos produtores, produz o ano todo e é mantenedora da fertilidade do solo. No aspecto nutricional, a banana é uma importante cultura de segurança alimentar, sendo considerada uma rica fonte de energia, sais minerais e vitaminas.A produção anual mundial ultrapassa 100 milhões de toneladas, sendo que praticamente 87% da área cultivada em todo o mundo é feita por pequenos produtores para consumo doméstico ou para venda em mercados locais eregionais. Os 13% restante da produção mundial de banana destina-se aomercado exportador e esta sob o domínio de grandes multinacionais americanas.Para muitos países, sobretudo os da América Latina e do Caribe, a exportação de banana constitui uma importante fonte de divisas estrangeiras.O Brasil é o segundo maior produtor mundial de bananas, tendo produzido 6,8milhões de toneladas (9,3% da produção mundial) no ano 2005, em uma área de499.230 hectares (FAO, 2007). A bananeira é cultivada de Norte a Sul do País, sendo fundamental para a complementação da dieta alimentar das populações debaixa renda. Praticamente toda fruta produzida é comercializada no mercado interno. A maioria dos bananicultores é composta por pequenos produtores, e osetor da bananicultura no Brasil gera mais de 500 mil empregos diretos. As regiõesNordeste e Sudeste do Brasil, juntas, respondem por 67% da produção nacional.O consumo efetivo de frutos situa-se na faixa de 70% da produção total, visto que embora as quantidades exportadas sejam mínimas, as perdas pós-colheita chegam a 30% da produção. Em 2002, os Estados maiores produtores foram: São Paulo (1.178.140 toneladas), Bahia (975.620 toneladas), Pará (537.900 toneladas), Santa Catarina (668.003 toneladas) e Minas Gerais (550.503 toneladas) (IBGE-SIDRA, 2007). III Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros 97Bananeira é uma espécie pertencente à família Musaceae típica de regiões tropicais e subtropicais, que apresenta grande importância econômica e social nomundo, uma vez que constitui fonte de renda e alimento para milhões de pessoas,embora o seu cultivo seja afetado por diversos problemas causados por fungos, bactérias, vírus, nematóides e insetos, além de estresses abióticos (Ribeiro, 2011).Uma das estratégias para a solução dos principais problemas é a obtenção denovas variedades resistentes a doenças, nematóides e insetos mediante programasde melhoramento (SILVA et al., 2003). O cultivo comercial de banana demanda, no seu contexto global, um amplo uso de pesticidas, levando a uma constante ameaça ao meio ambiente e à saúde humana nos países produtores pobres e à viabilidade econômica das indústrias. Somente um patógeno, o fungo M. fi jiensis exige em alguns países da América Latina entre 50-60 aplicações anual de fungicida. A importância do controle genético desse patógeno é de caráter urgente, já que a produção da banana emnível mundial vem passando por uma série de análises públicas de caráter críticoque demandam segurança alimentar e ambiental, dentro de um contexto de sustentabilidade da cultura.O promotor é uma região reguladora do DNA localizada upstream da sequência codante do gene, sendo constituído por sequências de nucleotídeos que funcionamcomo ponto de reconhecimento para a ligação da RNA polimerase, conferindo assim, um ponto de controle para a transcrição regulada do gene. Em eucariotos,o início da transcrição depende da ligação ao promotor de um conjunto deproteínas designadas fatores de transcrição. Estes fatores se ligam às sequênciaspromotoras, recrutando a RNA polimerase, a enzima que sintetiza o RNA a partirda região codante do gene (REMY et al., 2005). Como os promotores tipicamentesão imediatamente adjacentes ao gene em questão, a posição dos promotores édesignada relativamente ao sítio de inicio da transcrição, onde a transcrição doRNA começa por um gene em particular, ou seja, posições upstream são númerosnegativos iniciando a contagem pelo -1, por exemplo, -100 é a posição 100 paresde bases upstream (SANTOS et al., 2007). Com isso, os objetivos deste trabalhoforam isolar e clonar uma região promotora de expressão gênica de caráter tecido-específi co (folha) completo (full-promoter) e iniciar o processo de validaçãodeste promotor através da transformação genética de uma região promotora de expressão gênica em Musa spp.III Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros98Material e MétodosUma sequência potencialmente promotora de expressão gênica de caráter tecido-específi co foi selecionado no genoma da bananeira para clonagem e  transformaçãogenética de suspensão celular de uma variedade de bananeira, em sua versão completa (sem deleção, na versão de 2 kb). Para isso fora utilizados: i) isolamento, clonagem e transformação genética de suspensão celular embriogênica de banana via Agrobacterium utilizando uma região promotora (versão completa) de expressão gênica em Musa spp; ii) isolamento da região promotora (versão completa) de expressão gênica em Musa spp. de caráter tecido-específi ca.Os clones de BAC contendo o gene selecionado (associado ao promotor de interesse) foram obtidas no Global Musa Genomics Consortium (GMGC - http://www.musagenomics.org/). Para o isolamento do DNA plasmidial contendo oinserto onde se encontra o gene foi preparado 5 ml de meio LB líquido (contendo12,5 ug/mL de cloranfenicol) e em seguida inoculado no meio liquido parte domeio de cultura estoque (stab culture) utilizando ponteira estéril; em seguida estemeio líquido foi mantido sob agitação (220 rpm) a 37ºC por 16 horas. Após crescimento das bactérias foram preparadas duas alíquotas de 1 ml contendo 25%de glicerol e mantidas a -80ºC e os demais 3 ml foram utilizados para extração deDNA utilizando o kit Large-Construct (QIAGEN), segundo as recomendações dofabricante. Este DNA extraído foi quantifi cado e padronizado a 50 ng/ul. Ampliconscontendo as sequências dos promotores foram obtidos mediante uso do kit ProofStart PCR (QIAGEN), e as condições de amplifi cação foram  adaptadas à sequência do promotor a ser isolado, segundo recomendações do fabricante. 1.2. Clonagem da região promotora isolada em pDRIVE e pCAMBIA1319z.Estes amplicons foram submetidos ao kit A-adding (QIAGEN), e depois inseridosno vetor T/A pDRIVE (QIAGEN). Depois de inseridos no vetor pDRIVE, estes foramutilizados para transformar células competentes de E. coli XL1-Blue (Stratagene).O DNA plasmidial contendo o amplicon foi isolado das células bacterianas utilizando o kit QIAprep spin mini-prep (QIAGEN), e submetidos a digestão comenzimas de restrição para estimativa/confi rmação do tamanho do inserto. Estesclones foram então submetidos à sequenciamento para confi rmação da identidadedos insertos. Em havendo a confi rmação da identidade dos insertos, os mesmos seriam transferidos para o vetor pCAMBIA1391z.III Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros 99Este vetor apresenta uma versão sem promotor do gene gusA (N358Q), com oíntron do gene da catalase imediatamente “downstream” a uma sequência truncadade lacZa contendo o sitio múltiplo de clonagem dos vetores pUC8 ou pUC9. Ovetor pCAMBIA1391z apresenta o gene de resistência a higromicina como genemarcador de resistência para seleção de plantas, e o gene de resistência akanamicina como gene marcador de resistência para seleção de bactéria transformada. O lacZa truncado é funcional para discriminação entre colônias azuis e brancas de estirpes de E. coli. Após esta confi rmação, os promotores clonados seriam utilizados para transformação de células em suspensão de bananeiras de duas variedades disponibilizadas pela Embrapa Mandioca e Fruticultura (CNPMF).Resultados e DiscussãoApós o recebimento dos clones BAC pelo Global Musa Genomics Consortium (GMGC) procedemos ao processo de extração de DNA destas bactérias a fi m deisolarmos os fragmentos de DNA que tínhamos o interesse em trabalhar para aobtenção das sequencias de DNA dos promotores de interesse. No entanto, emum primeiro momento para nenhum dos clones BAC recebidos foi possível procedera extração do DNA. As bactérias não cresciam no meio LB com cloranfenicol. Alternativamente tentamos crescer as bactérias em meio 2YT contendo tambémo antibiótico. Novamente sem sucesso. Após 3 meses de tentativa solicitamos novamente ao GMGC novas bactérias paraserem enviadas o que foi feito somente no mês de maio deste ano. Após este grande atraso conseguimos proceder a extração do DNA dos clones BAC para isolamento da sequencia promotora de interesse. Uma vez feita a extração fi zemosa digestão com enzimas de restrição para liberação do fragmento e confi rmação do tamanho do fragmento esperado, sendo confi rmado em gel de agarose. Após esta confi rmação procedeu-se a clonagem da região promotora utilizando osvetores pDRIVE e pCAMBIA1319z, nesta etapa novo atraso devido a inefi ciênciados vetores, que já estavam armazenados a muito tempo. Mesmo assim, após 5tentativas foi possível a seleção dos clones para serem utilizados na transformação.Para a utilização dos clones selecionados foram feitos sequenciamentos de todos os clones selecionados (cerca de 60), os quais so foram sequenciados noinicio de julho, o que infelizmente não possibilitou a conclusão desta etapa porIII Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros100ainda não ter sido enviado. Após esta etapa, serão feitas as etapas de transformaçãodas suspensões celulares e seleção dos transformantes utilizando antibióticos seletores nos meio s de cultura.ConclusõesOs promotores de caráter tecido-específi co foram com muito atraso selecionadose isolados, no entanto, para que a etapa de transformação das suspensões celulares seja fi nalizada precisamos dos dados de sequenciamento. As células em suspensão de banana já estão prontas para serem transformadas.ReferênciasCORDEIRO, Z. J. M.; MATOS, A. P. Doenças da bananeira. In: FREIRE, F. C. O.;CARDOSO, J. E.; VIANA, F. M. P (Ed.). Doenças de fruteiras tropicais de interesseagroindustrial. Brasília, DF: Embrapa Informações Tecnológica, , 2003. P. 687.FAO. 2007. Disponível em: <http://faostat.fao.org>. Acesso em 13 setembro 2013.IBGE-SIDRA. 2007. Disponível em: <http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/agric/>. Acesso em 13 setembro 2013.REMY, S.; THIRY, E.; COEMANS, B.; WINDELINCKX, S.; SWENNEN, R.; SÁGI, L. Improved T-DNA vector for tagging plant promoters via high-throughput luciferase screening. BioTechniques,  Notick, v. 38, n. 5, p. 763-770, 2005.SANTOS, E.; REMY, S.; THIRY, E.; WINDELINCKX, S.; SWENNEN, R.; SÁGI, L.Characterization and isolation of a T-DNA tagged banana promoter active duringin vitro regeneration and low temperature stress. Journal of Experimental Botany,London, 2007. SOUZA JÚNIOR, M. T.; SANTOS, C. M. R.; MARTINS, N. F.; et al. DATAMusa: banco de dados de genômica de Musa spp. Brasília, DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2005. 24 p. (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, 107).

Isolamento e clonagem do promotor tecido-específico completo e transformação genética de musa spp.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/976021/1/pag.95.pdf

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