BRESSAN, W.

COELHO, V. T. S.

FIGUEIREDO, J. E. F.

FONSECA, P. C.

GOMES, E. A.

GUIMARAES, C. T.

LAGE, G. A.

MELO, M. A. V.

PAOLI, H. C.

QUINTÃO, P. L.

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Caracterização de Bactérias Endofíticas Isolados do MilhoCultivado no  groecossistema Cerrado_____________________________________________________________________________XXIV Congresso Nacional de Milho e Sorgo - 01 a 05 de setembro de 2002 - Florianópolis - SC_____________________________________________________________________________Coelho, V.T.S.1;Quintão, P.L.1; Paoli, H.C.1; Melo,M.A.V.1, Lage, G.A.1; Fonseca, P.C.2; Bressan, W.3; Guimarães, C.T.3; Gomes, E.A.3 Figueiredo, J.E.F.31Faculdades Metodistas Integradas Izabela Hendrix, Belo Horizonte, MG; 2Escola Superior de Agricultura e Ciências de Machado, Machado, MG; 3Embrapa Milho e Sorgo, CP 151, CEP 35701-970, Sete Lagoas, MG. jeff@cnpms.embrapa.brSDS-PAGE, RAPD-PCR, rDNA, Seqüenciamento, taxonomiaEndófitos são microrganismos que colonizam tecidos vegetais da parte aérea, sem causar danos à planta. Esse grupo de microrganismos coevoluiram e desenvolvem estreita relação com as plantas hospedeiras, influenciando mecanismos fisiológicos da planta. Sua importância na agricultura tem sido demonstrada pela melhoria no desempenho de plantas devido ao desenvolvimento de atividades antagonistas no controle de doenças bacterianas, insetos-praga e fitopatógenos. No presente estudo foram utilizadas as técnicas de SDS_PAGE, RAPD-PCR e rDNA (sequenciamento) para caracterizar 22 isolados de bactérias endofíticas do agroecossistema Cerrado com o objetivo de eliminar réplicas, determinar a variabilidade genética e estabelecer relações filogenéticas nesse importante grupo de microrganismos. A caracterização morfológica de colônias crescidas em meio D2, baseou-se na forma, elevação, brilho e cor. Dois grupos foram identificados: colônias circulares, de elevação ondulada, opaca e branca e, colônias circulares, de elevação achatada, transparente e amarela. A identificação da morfologia celular foi realizada por coloração de Gram, seguida de observação ao microscópio óptico (Figura 1). Todos os isolados apresentavam forma de bastonetes e reação de Gram positivas. Diferentes parâmetros bioquímicos foram utilizados para estabelecer os requerimentos nutricionais das bactérias isoladas. Utilizou-se o kit "BBL CRYSTALTM Gram-Positive ID System / GP" usando parte das colônias  isolados de bactéria, crescidos em meio D2. Após ter sido misturado a 2,0mL de solvente BBL Crystal a amostra foi vertida em painel com 29 substratos enzimáticos e bioquímicos e incubado entre 35-37oC por três horas, verificando depois as reações de cores, positivas ou negativas. Tal caracterização possibilitou agrupar esses microrganismos mas não permitiu discriminar cada isolado (Tabela I). O perfil eletroforético de extratos de proteínas totais (SDS-PAGE) foi obtido de culturas em meio LB. Alíquotas de 1,5 ml de bactérias crescidas durante 18 horas foram centrifugadas por dois minutos a 13.000 rpm e após descarte do sobrenadante, os sedimentos foram lavados com tampão PBS 1M pH 7,4 (NaCl, KCl, Na2PO4, KH2PO4), ressuspensos em 200ul de água estéril e colocados no gelo por 15 minutos. Em seguida adicionou-se 200ul de tampão às amostras que foram fervidas por 15 minutos e centrifugadas a 13.000 rpm por 30 segundos. Alíquotas de 15ul foram resolvidas em minigel de acrilamida de 12,5% corrido a 100V por duas horas e corados com Comassie blue. O perfil protéico revelou a existência de polimorfismo entre os isolados de bactérias endofíticas e possibilitou a identificação de réplicas existentes na coleção (Figura 2). A técnica de RAPD foi usada para estimar a variabilidade genética e estabelecer relações filéticas nesse grupo de bactérias. Foram utilizados 25 primers aleatórios (Operon) e as reações de amplificação foram realizadas com 10 ng de DNA genômico total extraído de colônias crescidas em meio LB. Cada reação, com volume de 25, l, continha 2,5 mM MgCl2, 25 uM dNTP, 2,5 mM Tris, 4,0 mM primer aleatório (10-mer), 1,5 U Tag DNA polimerase. A reação foi processada no termociclador "PTC-100TM (MJ Research. Inc.) programado com 15 segundos à 94oC para desnaturação do DNA, 30 segundos à 35oC para anelamento do primer e 30 segundos à 72oC para extensão da fita de DNA. Esse ciclo foi repetido 30 vezes e ao final acrescentou-se uma etapa de 10 minutos à 72oC. A resolução dos fragmentos amplificados foi feita em géis de agarose 1,2% e revelaram a existência de polimorfismo mesmo para isolados que apresentaram padrões morfológicos e bioquímicos similares (Figura 3). Os dados obtidos por RAPD-PCR confirmaram os achados de SDS-PAGE. Com base nesses resultados, optou-se por usar a técnica de SDS-PAGE para identificação de réplicas na coleção e empregar a técnica de RAPD-PCR para estimar a variabilidade genética e estudar as relações filogenéticas entre bactérias endofíticas de diferentes regiões agrícolas do Brasil. Análise por meio de amplificação e sequenciamento de genes ribossomais (16S e 23S) foi utilizada para estabelecer a identidade dos diferentes isolados de bactérias endofíticas (Figura 4). As condições das reações de amplificação foram as mesmas usadas para RAPD-PCR. Dados preliminares sobre o seqüenciamento da região (518-928) do gene 16S possibilitou a identificação inequívoca de cada um dos isolados, identificação de réplicas e revelou espécies ainda não descritas (dados não mostrados). Todos os isolados analisados até a presente data (12) pertencem ao gênero Bacillus (B. macroides, B. pumilus, B. subtilis, B. mojavensis, Bacillus sp. B. amiloliquefaciens). 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Caracterização de bactérias endofíticas isoladas do milho cultivado no agroecossistema cerrado.

Caracterização de bactérias endofíticas isoladas do milho cultivado no agroecossistema cerrado.

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