Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2016Intermediate Filaments are one of the major components of the cell cytoskeleton. They have an important role during stress and tissue damage. In the central nervous system, astrocytes are the most abundant cell type, and GFAP is the main component of astrocytic filaments. GFAP is involved in the reaction of astrocytes to CNS damage and it is associated to several diseases inside and outside the CNS, such as Alexander Disease, Crohn’s Disease.
Although GFAP was discovered in 1971, there is still no good model to study its oligomerization in living cells. The main goal of this study is to develop a new cellular model for the visualization and study of GFAP oligomerization in living cells.
Our model is based on bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays, which have been widely used to study protein-protein interactions in living cells. Briefly, GFAP was fused to two nonfluorescent halves of the Venus yellow fluorescent protein. When GFAP dimerizes, the Venus halves should get together and reconstitute the fluorophore. Fluorescence should therefore be proportional to the amount of GFAP dimers/oligomers.
We have tested three different BiFC pairs, but only one produced a fluorescence signal. However, its pattern of intracellular distribution does not match the normal GFAP fibrillary pattern. Instead, it produces a cytoplasmic signal with a rather heterogeneous distribution. When GFAP interacts with other proteins produces a different pattern specific of each interaction partner, producing aggregates in some cases. This suggests that GFAP behavior is only partially dependent on the tag, and can be modified by the intracellular context.
Further studies with all the possible combinations of venus halves in both N- and C-termini, or within GFAP, are needed to know if a BiFC system for GFAP or other intermediate filaments is actually possible.O citoesqueleto desempenha um importante papel na sobrevivência e comportamento celular. É responsável pela organização espacial dos conteúdos celulares, conectando fisicamente e bioquimicamente a célula ao ambiente externo e gerando forças coordenadas que permitem a célula a alterar a sua forma e a mover-se. Os filamentos intermédios são um dos principais componentes do citoesqueleto celular. Estes têm um papel especialmente importante durante o stress e dano dos tecidos.
No sistema nervoso central, os astrócitos são o tipo celular mais abundante. Os astrócitos têm funções importantes tanto na doença como na saúde. As ligações moleculares formadas pelos astrócitos guiam a migração dos axónios em desenvolvimento e alguns neuroblastos durante a formação da matéria branca e cinzenta. Os astrócitos também estão envolvidos na transmissão sinática, na maturação dos oligodendrócitos e na mielinização dos nervos. Em condições patologicas tais como doenças neurodegenerativas, os astrócitos reagem, tornam-se hipertróficos e proliferam para pôr límite ao dano. Se a barreira hematoencefalica é danificada, eles forman uma cicatriz e fecham a ferida, limitando assim a extensão da lessão. A proteina ácida fibrilar glial (GFAP) é a principal componente dos filamentos astrociticos. A GFAP está envolvida na reação dos astrócitos ao dano no sistema nervoso central e está associada a várias doenças dentro e fora do sistema nervos central, tais como a doença de Alexander ou a doença de Crohn’s. A GFAP é também o principal marcador para a identificação de astrócitos, e o seu promotor é utilizado de uma forma extensiva para a expressão de genes específicos em astrócitos. A GFAP tende a formar filamentos de 10 nm. Em primeiro lugar duas moléculas de GFAP ligam-se uma à outra e formam dímeros, que por sua vez ligam-se a outros dímeros dando origem a protofilamentos. Por último estes protofilamentos tendem a juntar-se e formar então os filamentos maturos. Quando a GFAP é sobreexpresa ou sofre mutações, como acontece em alguns tipos de cancro e na doença de Alexander, a GFAP forma agregados fibrilares patológicos conhecidos como fibras de Rosenthal.
Apesar da GFAP ter sido descoberta em 1971 ainda não há um bom modelo que permita o estudo da sua oligomerização em células vivas. Até agora, todas as tentativas de visualização da oligomerização resultam em padrões difusos e de agregação da GFAP ao contrário do aspeto normal de filamentos intermédios. Com isto, o principal objetivo deste estudo é desenvolver um novo modelo celular para a visualização e estudo da oligomerização da GFAP em células vivas.
O nosso modelo é baseado no sistema de ensaios de fluorescência por complementação bimolecular (BiFC) que tem sido amplamente utilizado para estudar interações entre proteínas em células vivas. Este sistema tem como base a utilização de duas metades não fluorescentes de uma proteína fluorescente que são acopladas a uma proteína de interesse. Aquando a interação das proteínas de interesse, as metades não fluorescentes vão interagir e reconstituir o fluoróforo. A fluorescência originada permite assim calcular, indiretamente, os níveis de dimerização da proteína e interesse e a localização intracelular dos dímeros. A criação do sistema é feita de uma maneira empírica, havendo uma série de possibilidades tanto no local de corte da proteína fluorescente como na localização destas em relação à proteína fluorescente. Diferentes tamanhos das metades não fluorescentes levam a diferentes níveis de background o ao tratamento prévio das células para potenciar os níveis de fluorescência. O acoplamento à proteína de interesse pode ser na parte N- ou Cterminal, e pode levar um linker entre a metade fluorescente e a proteína de interesse para incrementar a flexibilidade da fusão.
Resumidamente, a GFAP foi ligada a duas metades não fluorescentes da proteína fluorescente amarela Venus. Quando a GFAP dimeriza, as metades da Venus juntam-se e reconstituem o fluoróforo. A fluorescência é proporcional à quantidade de dímeros/oligómeros de GFAP.
Testámos três combinações diferentes dos constructos de BiFC GFAP-Venus. Todas as combinações incluíam o plasmídeo Venus 1 – GFAP emparelhado com três plasmídeos de Venus 2 – GFAP diferentes, sendo eles GFAP - Venus 2 (amino ácidos 158-238), GFAP – Venus 2 (amino ácidos 210-238) e Venus 2 (amino ácidos 210-238) - GFAP.
Apenas o primeiro apresentou fluorescência. Isto não foi devido a diferenças ou deficiências na expressão da GFAP, que foi confirmada por meio de anticorpos específicos e ensaios western blot em todos os cassos. Contudo, em comparação com outros sistemas de BiFC já desenvolvidos, os níveis de fluorescência foram reduzidos. Quando verificamos através de microscopia o comportamento da GFAP, o seu padrão de distribuição intracelular não coincide com o padrão normal de fibrilação. Ao invés, produz um sinal citoplasmático com uma distribuição heterogénea. Fibras de Rosenthal ou outros padrões de agregação não foram observados, no entanto como já foi referido anteriormente o sinal não delineava a rede de filamentos intermédios regular.
Em seguida, de modo a verificar se a GFAP interagia com outras proteínas e também produzia padrões de agregação, transfetou-se células com o plasmídeo GFAP – Venus 1 em combinação com outros plasmídios carregando proteínas relacionadas com neurodegeneração ligadas a Venus 2. Um grupo dessas proteínas está diretamente envolvido em doenças neurodegenerativas, com uma forte tendência para agregação e localizadas principalmente no citosol, que inclui a huntigtina, a proteina tau, a synucleina e a DJ-1. O outro grupo de proteínas é maioritariamente constituído por factores de transcrição (STAT3 e p53) ou os seus reguladores (mdm2), e usualmente não produz agregados estando localizadas no núcleo e citosol. Quando a GFAP interage com outras proteínas produz um padrão diferente especifico de cada proteína de interação, produzindo agregados em alguns casos. No primeiro grupo produz níveis de fluorescência maiores em comparação com o segundo grupo. Estes resultados sugerem que o comportamento da GFAP é apenas parcialmente dependente do tag e pode ser modificado pelo contexto intracelular.
No presente estudo, não foi possível desenvolver, até à data, um sistema de BiFC que permita a visualização e estudo da GFAP normal e aberrante. No entanto foi possível retirar algumas conclusões. A partição das metades não fluorescentes 1 a 210 e 210 a 238 não é funcional, pelo menos no contexto da proteína GFAP, ou seja, não há sinal de fluorescência. O único par funcional de todos os testados não reproduz a distribuição intracelular esperada para a GFAP apesar de apresentar níveis de fluorescência. Também se verificou que a GFAP pode co-agregar seletivamente com várias proteínas relacionadas com doenças neurodegenerativas.
Mais estudos com todas as possíveis combinações das metades da Venus nos terminais N- e C-, ou dentro da GFAP, são necessários para perceber se um sistema BiFC para a GFAP ou outros filamentos intermédios é realmente possível. Um sistema assim permitiria analizar os mecanismos moleculares da formação de oligomeros e fibras normais ou aberrantes (Rosenthal fibers) da GFAP. Por causa do importante papel dos astrócitos e da GFAP na reação ao dano no sistema nervoso central e nos plexos nervosos do intestino, o nosso modelo podería contribuir à compreensão e tratamento dum grande número de doenças humanas tais como as doenças de Alzheimer o Parkinson, acidentes cerebro-vasculares, trauma cerebreal o espinal, o a doença de Crohn
