已有研究表明，对肿瘤的化疗可导致ATM（ataxia-telangiectasiamutated，ATM）相关的肿瘤细胞多药耐药（multipledrugresistance，MDR）的产生，而炎症因子IL-6水平也与MDR的形成密切相关。但到目前为止，ATM活化在IL-6所引起的MDR形成中的作用仍不明。因此，本实验主要对IL-6在肺癌细胞中引起MDR的通路机制进行研究。 为探究IL-6和ATM在化疗药所致MDR形成中的作用，我们以NCI-H446和A549细胞为小细胞肺癌和非小细胞肺癌模型，首先观察NCI-H446和A549细胞对化疗药顺铂和喜树碱的敏感性，进而采用Westernblot...Documented studies showed that ATM was contributed to the up-regulation of multidrug resistance associated genes. Meanwhile, IL-6 was also reported to play important roles in chemotherapy resistance. But the exact role of ATM in IL-6 induced MDR formation was still unknown. To explore the roles of IL-6 and ATM in chemotherapeutic drugs-induced MDR formation, the IL-6 expression and chemotherapy se...学位：理学硕士院系专业：医学院_微生物学学号：2452010115332

黄晓波

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厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库2 学校编码：10384                               分类号      密级        学号：24520101153322                                      UDC                    硕  士  学  位  论  文                                            IL-6 激活 ATM/NF-κB 通路致肺癌细胞化疗耐药的作用研究 IL-6 Treatment Contributed to Chemotherapeutic Resistance by Activating ATM/NF-κB Pathway in Lung Cancer Cells 黄 晓 波  指  导 教 师：高丰光 教授 专  业 名 称：微 生 物 学 论文提交日期：2013 年 5 月 论文答辩时间：2013 年 5 月 学位授予日期：2013 年 6 月   答辩委员会主席：           评    阅    人：             2013 年 4 月 厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库                      厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库厦门大学学位论文原创性声明  本人呈交的学位论文是本人在导师指导下,独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和《厦门大学研究生学术活动规范（试行）》。 另外，该学位论文为（                           ）课题（组）的研究成果，获得（               ）课题（组）经费或实验室的资助，在（               ）实验室完成。（请在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特别声明。）   声明人（签名）：         厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库                  厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库 厦门大学学位论文著作权使用声明  本人同意厦门大学根据《中华人民共和国学位条例暂行实施办法》等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交学位论文（包括纸质版和电子版），允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： （     ）1.经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于   年  月  日解密，解密后适用上述授权。 （  √ ）2.不保密，适用上述授权。 （请在以上相应括号内打“√”或填上相应内容。保密学位论文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用上述授权。）                               声明人（签名）：   厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库  厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库缩略语索引   I缩略语索引 缩略语 英文全名 中文全名 DDP camptothecin 顺铂 CPT cisplatin 喜树碱 MDR Multidrug resistance 多药耐药 IL-6 Interleukin-6 白细胞介素-6 ABCG2 ATP-binding cassette superfamily G number 2 ATP 结合转运蛋白 G 家族 2NCI-H446 cells Human small cell lung cance cell 人小细胞肺癌细胞 SCLC small cell lung cance 小细胞肺癌 NSCLC nonsmall cell lung cance 非小细胞肺癌 ATM ataxia telangietisa mutanted 共济失调突变 NF-κB nuclear factor- қB 细胞核因子 қB ELISA enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验 RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction 逆转录多聚酶链反应 FCM  flow cytometry 流式细胞术 FBS fetal bovine serum 胎牛血清 FITC fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素 PI Promide iodine 碘化丙啶 TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine 四甲基乙二胺 BSA Bovine Serum albumin 小牛血清白蛋白 Tris  Trihydroxymethyl aminomethane 三羟甲基氨基甲烷 Arc Acrylamide 丙烯酰胺 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠 TBS Tris Buffered Saline Tris 缓冲液 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 EDTA Ethylenediamine tracetic acid 乙二胺四乙酸 DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库缩略语索引   IIAPS ammonium persulfate 过硫酸铵 TMB tetramethylbenzidine 四甲基联苯胺 JAK2 Janus Kinases Janus 激酶 STAT3 signal transducers and activators of transcription 3 信号转导和转录活化因子 3  ①注：以上排列按下文出现先后排序。厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库摘要  III 摘 要 已有研究表明，对肿瘤的化疗可导致ATM（ataxia-telangiectasia mutated, ATM）相关的肿瘤细胞多药耐药（multiple drug resistance, MDR）的产生，而炎症因子IL-6水平也与MDR的形成密切相关。但到目前为止，ATM活化在IL-6所引起的MDR形成中的作用仍不明。因此，本实验主要对IL-6在肺癌细胞中引起MDR的通路机制进行研究。 为探究IL-6和ATM在化疗药所致MDR形成中的作用，我们以NCI-H446和A549细胞为小细胞肺癌和非小细胞肺癌模型，首先观察NCI-H446和A549细胞对化疗药顺铂和喜树碱的敏感性，进而采用Western blot、RT-PCR和ELISA检测两种细胞系中IL-6的表达差异。其次，采用Western blot、RT-PCR和免疫荧光激光共聚焦检测IL-6对MDR相关蛋白ABCG2、Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1表达的影响及ATM/NF-κB的活化情况。再次，使用通路抑制剂，探讨IL-6引起MDR的通路机制和IL-6产生的机制。 后，通过细胞活力的检测，探讨ATM/NF-κB抑制剂CGK和BAY11-7082对肺癌细胞化疗效果的影响。 实验结果显示：1、ELISA结果发现，A549细胞中IL-6的表达量是NCI-H446细胞的3.9倍，同时A549细胞对化疗药的敏感性更低。流式结果发现，低表达IL-6的NCI-H446细胞经顺铂处理后细胞凋亡率为54.31%，IL-6预处理组细胞凋亡率则降低至13%，细胞凋亡率下降67.3%。2、在低表达IL-6的NCI-H446细胞中，IL-6预处理0-120分钟，可在蛋白水平和mRNA水平上增加耐药和抗凋亡相关蛋白的表达，30分钟左右作用 为明显。3、低表达IL-6的NCI-H446细胞经IL-6的预处理0-120分钟后，Western Blot结果表明，ATM、IκBα和p65磷酸化水平都有所增加，免疫荧光激光共聚焦也得到类似结果。4、Western blot结果发现，ATM激酶抑制剂CGK可减少p65的磷酸化，表明IL-6所致的NF-κB通路的激活依赖于ATM的磷酸化，免疫荧光激光共聚焦也得到类似结果。同时ATM/NF-κB的激酶抑制剂预处理可降低IL-6上调的耐药和抗凋亡相关蛋白的表达。5、以顺铂和喜树碱分别处理NCI-H446细胞24小时和48小时，ELISA检测发现，IL-6的表达分别提高了198%和160.5%。6、Western blot结果发现，IL-6可激活p38和NF-κB信号通路，厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库摘要  IV 而使用NF-κB和p38信号通路的抑制剂处理NCI-H446细胞后，ELISA结果显示，顺铂和喜树碱所诱导的IL-6表达分别降低了58.1%、28.2%和33.3%、14.2%。7、ATM和NF-κB信号通路激酶抑制剂预处理NCI-H446细胞，与单独使用化疗药组相比，NCI-H446细胞活力更低，光镜观察结果也发现，经BAY11-7082或CGK/ BAY11-7082处理后，NCI-H446细胞凋亡更为明显。 总结以上实验结果，我们得出结论：化疗药顺铂和喜树碱可激活p38和NF-κB信号通路诱导肺癌细胞NCI-H446细胞中IL-6的表达，而IL-6又可激活ATM/NF-κB信号通路，进而上调MDR相关蛋白的表达。提示在肺癌化疗中，IL-6和ATM可作为克服MDR的潜在分子靶点，以改善肺癌化疗效果。 关键词：IL-6, ATM, NF-κB, MDR, Chemotherapy             厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库Abstract  V Abstract Documented studies showed that ATM was contributed to the up-regulation of multidrug resistance associated genes. Meanwhile, IL-6 was also reported to play important roles in chemotherapy resistance. But the exact role of ATM in IL-6 induced MDR formation was still unknown. To explore the roles of IL-6 and ATM in chemotherapeutic drugs-induced MDR formation, the IL-6 expression and chemotherapy sensitivities ofNCI-H446 and A549 cells were firstly determined by microscope observation, Western blot, RT-PCR, Elisa, cytometry respectively; Then, the IL-6 effects on MDR associated proteins expression and ATM/ NF-κB activation were further explored by Western blot, RT-PCR and confocal observation; Using kinase inhibitors, the mechanisms of IL-6 induced MDR formation and the IL-6 source were investigated by flow cytometry, Western blot and ELISA respectively; Moreover, the effects of ATM/NF-κB kinase inhibitors on chemotherapy sensitivities were further investigated by cell viability assay. The results showed that: Firstly, A549 cells which had higher IL-6 secretion could achieve lower sensitivity to chemotherapy than NCI-H446 cells did. The decrease of cisplatin-induced cell apoptosis was also found when IL-6 was added to NCI-H446 cells; Secondly, A549 cells had higher MDR associated protein ABCG2, Bcl-2, Mcl-1, Bcl-xl expressions than NCI-H446 cells did. The IL-6 treatment could up-regulate NCI-H446 cells` ABCG2, Bcl-2, Mcl-1, Bcl-xl expressions in both transcription and translation level; Thirdly, ATM phosphorylation dependent NF-κB activation in NCI-H446 cells was achieved in IL-6 treated condition; Interestingly, the up-regulations of ABCG2, Bcl-2, Mcl-1, Bcl-xl induced by IL-6 treatment could be impaired by the usage of NF-κB and ATM inhibitors; Most importantly, cisplatin/camptothecin-induced IL-6 up-regulation could be decreased by the usage of p38 and NF-κB kinase inhibitors.  Lastly, ATM/NF-κB inhibitors could increase NCI-H446 cells sensitivities to chemotherapy in IL-6 treated condition. All the results present here demonstrated that camptothecin/cisplatin could increase IL-6 expression by activating p38/NF-κB 厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库Abstract  VI pathway and ATM/NF-κB pathway could be activated by IL-6 treatment, which hence up-regulate MDR associated ABCG2, Bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1 expression, indicating that IL-6 and ATM as potential molecules to overcome resistance formation in lung cancer chemotherapy.  Key words: IL-6, ATM, NF-κB, Multidrug Resistance, Chemotherapy厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库目录  1 目 录 缩略语索引 ................................................................................................ I 中文摘要 ................................................................................................. III 英文摘要 ................................................................................................... V 前言 ............................................................................................................. 1 实验材料和方法 ........................................................................................ 4 1. 实验材料 ............................................................................................................. 4 2. 实验方法 ............................................................................................................. 8 实验结果 .................................................................................................. 23  1. 肺癌细胞所处环境的 IL-6 水平与其对化疗药的敏感性密切相关...............错 误 ！ 未 定 义 书 签 。 2 3  2. 肺癌细胞所处环境的 IL-6 水平与其抗凋亡蛋白 Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1 和耐药相关基因 ABCG2 的表达密切相关 .............................................................. 23  3.在肺癌细胞中，IL-6 可激活 ATM 和 NF-κB 通路 ....................................... 25  4.ATM 的激活参与 IL-6 所致的 NF-κB 通路的活化 ...................................... 28  5. IL-6 通过激活 ATM/NF-κB 通路上调 ABCG2 和抗凋亡蛋白B c l - 2 、Bcl-XL、Mcl-1 的表达............................................................................................30  6. 顺铂和喜树碱可诱导肺癌细胞产生 IL-6 ...................................................... 31  7 .  顺铂和喜树碱通过 p 3 8 和 N F -κB 信号通路诱导 I L - 6 的产生...............................................................................................................................3错 误 ！ 未 定 义 书 签 。 8 .  AT M 和 N F -κB 激酶抑制剂可增加肺癌细胞对化疗药的敏感厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库目录  2 性...............................................................................................................................35 讨论 ........................................................................................................... 37 结论 ........................................................................................................... 40 参考文献 .................................................................................................. 41 文献综述 .................................................................................................. 48 参考文献 .................................................................................................. 55 致谢 ........................................................................................................... 61 厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库Table of Contents  1  Table of Contents Abbreviations ............................................................................................ I Abstract in Chinese ................................................................................ III Abstract in English .................................................................................. V Introduction ............................................................................................... 1 Materials and Methods ............................................................................. 4 1. Materials ................................................................................................................ 4 2. Methods ................................................................................................................. 8 Results ...................................................................................................... 23 1. The environmental IL-6 level of lung cancer cells is correlated with the sensitivity to chemotherapy drugs. ........................................................................23 2. The environmental IL-6 level of lung cancer cells is correlated with the expression of Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 and ABCG2 ...................................................23 3. IL-6 could activate ATM and NF-κB pathway in lung cancer cells…..…… 25 4. ATM phosphorylation was involved in NF-κB activation induced by IL-6 .. 错误！未定义书签。28 5. IL-6 increased the expression of Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1 and ABCG2 via p-ATM/NF-κB pathway ......................................................................................... 30 6. Cisplatin or camptothecin could induce IL-6 production in lung cancer cells .................................................................................................................................. 31 7. Cisplatin or camptothecin could up-regulate IL-6 expression through p38 and NF-κB pathways .............................................................................................. 33 8. The usage of ATM and NF-κB inhibitors could enhance susceptibility to chemotherapeutic agents in NCI-H446 cells…..……………………………….. 35 厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库Table of Contents  2  Discussion ................................................................................................. 37 Conclusion ............................................................................................... 40 References ................................................................................................ 41 Article Review ......................................................................................... 48 References ................................................................................................ 55  Acknowledgement ................................................................................... 61 厦 门 大 学 博 硕 士 论 文 摘 要 库Degree papers are in the “Xiamen University Electronic Theses and Dissertations Database”. Fulltexts are available in the following ways: 1. 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IL-6 Treatment Contributedto Chemotherapeutic Resistance by Activating ATM/NF-kB Pathway in Lung Cancer Cells.

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IL-6 Treatment Contributedto Chemotherapeutic Resistance by Activating ATM/NF-kB Pathway in Lung Cancer Cells.

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