铁蛋白是广泛存在于生物体内的储存铁的蛋白质 ,它参与生物体内的铁代谢。本文从铁蛋白的亚基结构、血红素  电子隧道、铁氧化酶位点和捕获重金属离子角度 ,综述铁蛋白纳米蛋白壳的结构与功能研究的新进展

孔波

王群力

黄河清

Xiamen University Institutional Repository

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net　　收稿 : 2003 年 5 月 , 收修改稿 : 2003 年 8 月　3 国家自然科学基金资助项目 (No. 40276033)3 3 通讯联系人 　e2mail :hqhuang @jingxian. xmu. edu. cn铁蛋白纳米蛋白壳结构与功能研究新进展 3王群力　孔　波　黄河清 3 3(厦门大学生命科学学院 福建省化学生物学重点实验室 　厦门 361005)摘 　要　铁蛋白是广泛存在于生物体内的储存铁的蛋白质 ,它参与生物体内的铁代谢。本文从铁蛋白的亚基结构、血红素2电子隧道、铁氧化酶位点和捕获重金属离子角度 ,综述铁蛋白纳米蛋白壳的结构与功能研究的新进展。关键词 　铁蛋白 　纳米蛋白质壳 　结构与功能中图分类号 : Q617 　文献标识码 : A 　文章编号 : 10052281X(2004) 0420516204Progress in Structural and Functional Study of Nanometer Protein Shellof the FerritinWang Qunli 　Kong Bo 　Huang Heqing 3 3(School of Life Science , The Key Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province ,Xiamen University , Xiamen 361005 , China)Abstract 　Ferritins are ubiquitously distributed in organisms and take an important role in iron metabolism. In thispaper , the subunit structure , heme electron tunnel , site of ferroxidase and trapping of various kinds of metal ions from theferritin have been described. New development on structure and function of nanometer protein shell of ferritin is shown.Key words 　ferritin ; nanometer protein shell ; structure and function　　在自然界中 ,铁是绝大多数生物有机体进行新陈代谢所必需的过渡重金属元素之一 ,其含量高低对维持细胞正常生长和代谢起着重要的作用。而铁蛋白 (ferritin)是参与和维持铁代谢平衡的重要功能蛋白 ,它是一类广泛存在于动植物及微生物细胞中含高铁量的蛋白质。在体内 ,铁蛋白的主要生理功能是储存机体中的过剩铁 ,避免产生铁中毒和释放铁给需铁的细胞 ,用于体内生物合成含铁的蛋白质或酶[1 —3 ] 。在动植物和微生物机体中 ,铁蛋白基因缺失或其生理功能异常可能导致生物机体的死亡。对于人类而言 ,许多疾病 ,如缺铁性贫血、血色症、铁中毒、恶性肿瘤等都与铁代谢异常有关 ,因此人类血清铁蛋白可作为评判许多重大疾病的标志物[4 ] 。近十几年来 ,国内外医学科学研究机构对铁蛋白结构与功能的研究呈上升趋势 ,一系列特色研究成果均取材于具有纳米尺寸的铁蛋白的蛋白质壳。本文侧重从铁蛋白蛋白壳的纳米结构角度 ,综述铁蛋白的亚基结构、血红素2电子隧道、铁氧化酶位点和捕获重金属离子的最新研究进展。一、铁蛋白蛋白壳亚基结构与功能铁蛋白广泛存在于各种动植物、微生物细胞中 ,含有高量的铁和磷 ,具有耐稀酸 (pH 210) 、耐稀碱(pH 1210) 、耐较高温度 (70 —75 ℃温度下长时间不变性)等抗逆性特点。铁蛋白外形结构呈球形 (图1) ,由蛋白壳和铁核两部分组成 ,前者是由 24 个亚基高度对称性地组成的内空腔结构 ,而后者是由数千氢氧化铁分子和数百磷酸盐分子组成非均匀的铁核结构 ,并可划分为高磷铁比的铁核表层和低磷铁比铁核内层结构 ,用于较合理地解释铁蛋白一些特第 16 卷 第 4 期2004 年 7 月化　学　进　展PROGRESS IN CHEMISTRYVol. 16 No. 4　July , 2004© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net　　　　　　　　图 1 　铁蛋白分子结构A :蛋白壳 ;B :铁核 ;C :电子隧道Fig. 1 　Molecular structure of ferritinA :protein shell ; B :iron core ; C :electron tunnel殊生理功能。蛋白壳外直径约为 11 —13nm ,蛋白壳的内直径为 8 —9nm 的空腔 ,铁核位于蛋白壳中心 ,直 径 约 为 7 —8nm , 蛋 白 壳 的 厚 度 约 为 2 —215nm[1 —3 ,5 ,6 ] 。电子显微镜技术研究报道 ,不同来源的铁蛋白或经纯化后的同一种蛋白样品中 ,其铁核直径大小不同 ,这与铁蛋白储存铁量高低有着对应关系。来自于动物、植物和微生物的蛋白壳和壳内空腔直径有明显差别 ,这一现象与蛋白亚基之间形成高级结构紧密程度有关 ,并会引起不同电泳迁移率和等电点等生化参数的差异。目前 ,作者已采用生物质谱技术研究了鲨鱼肝、海兔肝、马脾和猪脾铁蛋白质谱特性 ,发现了各种蛋白的亚基分子量之间极为相似 ,未存在明显差别 ,从而进一步阐明了作者提出有关铁蛋白蛋白壳柔性调节能力和蛋白亚基之间的结合紧密程度对发挥铁蛋白的生理功能起到重要的作用 ,它为合理解释铁蛋白释放铁过程中呈现复杂动力学特性提出新颖的观点和实验证据。迄今为止 ,许多不同来源的铁蛋白已经得到分离 ,并且一级结构已经得到测定。哺乳动物铁蛋白由两类亚基组成 ( H 亚基和 L 亚基) ,同种个体铁蛋白的 H亚基和 L 亚基之间有 54 %的保守氨基酸顺序 ,不同种哺乳动物之间 H 亚基和 L 亚基的氨基酸组成分别有 90 %和 85 %同源性[1 ,2 ] 。鲨鱼是属于哺乳动物类 ,但鲨鱼肝铁蛋白由单亚基组成 ,其亚基组成和一级结构同源性与细菌铁蛋白很相似。来源于无脊椎动物、植物、微生物的铁蛋白只含有一种亚基 ,其特性与哺乳动物 H 亚基相近 ,但生理功能相当于哺乳动物铁蛋白两个亚基合为一体时所表达的功能。与哺乳动物铁蛋白和细菌铁蛋白不同 ,植物图 2 　铁蛋白亚基的二级结构A、B、C、D :α螺旋 ; E : 短螺旋Fig. 2 　Second structure of ferritin subunitA、B、C、D :α2helix ; E: short helix铁蛋白在 N2末端还有两个附加的肽序列 :转运肽(TP)和伸展肽 ( EP) ,其中 TP 参与引导和转运蛋白亚基到质体 ,并且 TP 的裂解是蛋白壳装配的必要步骤 ,而 EP 可能与组装后的铁蛋白在细胞内的定向迁移有关。在哺乳动物体内 ,H 亚基和 L 亚基的组成比例可随动物细胞的增殖、分化、发育阶段的不同而变化 ,这种非均匀性与铁蛋白在不同的器官和发育阶段的功能是相一致的。近期 ,采用毛细管凝胶分离技术测定马脾铁蛋白 H 和 L 亚基组成比例[8 ] ,如这一技术能与铁蛋白功能相结合 ,对正确理解铁蛋白纳米蛋白壳结构与功能可能起到重要的作用。　　不同来源的铁蛋白亚基的一级结构差异很大 ,但其蛋白壳空间结构表现出高度的保守性。铁蛋白亚基从 N 端起形成 4 个α螺旋 (A、B、C、D) 区域 ,最后以短螺旋 ( E) 构成 C 末端。在 N 端和 C 端及 AB和 DE转弯处均有短非螺旋区 ,而在 BC 间为一长环L (图 2) 。4 个长螺旋以反平行方式排列成螺旋束 ,短双螺旋 ( E) 与螺旋束形成 60°角。24 个亚基每两个亚基为一对 ,每对中的亚基相互平行 ,首尾相对 ,构成菱形十二面体的一个面 ,这个十二面体最终构成呈 432 点对称的蛋白壳。在这个十二面体上沿二、三、四重轴分别为由铁蛋白亚基与亚基之间组成的 12 个二相隧道、8 个三相隧道和 6 个四相隧道 。一旦亚基组装成对称结构后 ,4 个短螺旋 ( E) 平行排列在四相隧道上。迄今为止 ,对于上述 3 种隧道的·715·第 4 期 王群力等 　铁蛋白纳米蛋白壳结构与功能研究新进展© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net功能仍然存在不同的看法和争论 ,但目前已达成的共识是 ,三相隧道是物质进出蛋白壳的通道 ,因此三相隧道也被称为三相物质交换隧道。而四相隧道和电子隧道推测可能参与铁贮存和释放过程中的电子传递反应 ,但其作用及功能的看法仍然有争议[7 —10 ]。早期的研究认为三相物质隧道为 018 —112nm ,而后来研究证明隧道宽度为 014 —015nm ,但直径017 —019nm 的探针却可以通过物质隧道而被贮存在蛋白壳内 ,例如 ,甲基紫精、中性红和有机磷农药等。因而认为该蛋白的蛋白壳并不是刚性结构 ,而是柔性结构 ,有一定的柔性调节能力 ,物质隧道宽度可以在一定范围内变化 ,因此稍大于隧道宽度的物质能够通过三相物质隧道而被贮存[11 ,12 ] 。二、血红素2电子隧道结构和作用蛋白壳上除物质隧道以外 ,还存在电子隧道。电子隧道由蛋白壳上的一些氨基酸残基组成 ,其功能是负责电子的传递 ,加速铁蛋白储存和释放铁的速率。细菌铁蛋白蛋白壳与其他铁蛋白不同之处在于具有血红素组成 ,它以共价键的方式结合在蛋白壳相邻亚基形成的口袋状结构中 ,参与蛋白壳上电子隧道的组成 ,构成血红素电子隧道结构[8 —10 , 13 ,14 ] 。在自然界中 ,绝大多数蛋白质在物理电极上呈电惰性特性 ,而横跨细菌铁蛋白壳的血红素2电子隧道结构却能直接从铂金电极上获得还原电子 ,用于自身铁还原反应 ,是一种非电极惰性的蛋白质。哺乳动物铁蛋白不含有血红素 ,但它具有与细菌铁蛋白类似的血红素结合位点。体外试验表明血红素同样能络合于哺乳动物铁蛋白壳外表层 ,而且提高了释放铁的速率 ,这说明血红素可以参与哺乳动物铁蛋白电子隧道的构成。直接电化学技术发现了哺乳动物铁蛋白能直接从铂金或黄金电极上获得电子 ,并直接还原自铁核中的铁[9 ,10 ,15 ] 。这一发现 ,为研制铁蛋白电极 ,并直接用于分析生物大分子氧化还原特性提供了可行性依据。2002 年 ,Park 等人选用高分辨率的双向凝胶电泳技术分离人类铁蛋白轻链亚基 ,用胰蛋白酶消化技术和基质辅助激光解析离子化飞行时间 (matrix2assisted laser desorption ionizationΠtime of flight , MAL2DI2TOF)质谱技术研究该亚基的肽指纹图谱 ,并用于轻链亚基的部分一级结构 [16 ] 。近期 , 作者采用MALDI2TOF 利用质谱技术 ,发现鱼肝铁蛋白蛋白壳外表层存在着高密度的正电荷区域 ,它为阐明铁蛋白是非电极惰性蛋白质和电子隧道功能提供了实验证据[17 ] 。三、纳米蛋白壳中铁氧化酶位点和结构近十几年来 ,有关铁蛋白 H 和 L 亚基的结构和功能一直是铁蛋白研究的热点课题之一。H 亚基与L 亚基的差别不仅仅是分子量 ,而且在结构上也存在着明显的差异。H 亚基含有大量的酸性氨基酸 ,它们位于四螺旋束的中心 ,形成铁氧化中心。L 亚基不含有这些酸性氨基酸 ,但存在成核位点 ,其主要功能是促进铁的水解和核的形成。在铁蛋白储存铁的初期 ,亚铁离子在 H 亚基铁氧化酶中心被氧化成Fe3 +,并形成含铁2磷的二聚体水合物 ,然后该二聚体在成核位点被水解 ,最终形成铁核。因此 H 和 L亚基两者并非孤立起作用的 ,它们之间需相互作用才能完成铁蛋白储存和释放铁的功能[1 —3 ,18 ] 。但 H亚基和L 亚基只是起始铁核的形成 ,当铁核形成以后 ,铁氧化和成核作用就在铁核表面进行。细菌铁蛋白、植物铁蛋白和鲨鱼肝铁蛋白只含有一种亚基 ,但它们的亚基同时具有哺乳动物铁蛋白的 H 和 L亚基的特性 , 同样存在铁氧化中心和成核位点[1 ,2 ] 。　　四、铁蛋白新功能的研究铁蛋白在正常的生理条件下 ,其功能是储存机体内过剩的铁和释放铁给需铁的细胞 ,亚铁离子作为天然底物可以在体外和体内被组装进蛋白壳。随着铁蛋白研究的深入 ,在体外利用其蛋白壳纳米空间的新功能研究取得了很大的进展。体外研究表明铁蛋白可以捕获较多数量的非铁重金属离子 ,因此其可能参与了体内重金属离子的解毒。铁蛋白捕获金属离子的机制非常复杂 ,位点包括蛋白壳的内外表面、三相和二相隧道及铁核表面和深层。同一结合位点可以结合不同的金属离子 ,而同一金属离子也可以结合不同的位点 ,但不同位点的结合能力存在差异[19 ,20 ] 。以前的研究都着重于利用其它重金属离子作为与铁离子竞争的探针来研究铁蛋白储存和释放铁的机制 ,而最新的研究表明可以利用铁蛋白这种捕获金属离子及抗逆的特性 ,构建铁蛋白反应器并用于野外连续监测流动水体的重金属离子污染程度[21 ] 。在体外特定的条件下 ,一些金属核如 FeS 核、CdS核、Mn3O4 核、Fe3O4 磁性铁核及放射性材料的铀核 ,已被成功地组装到铁蛋白蛋白壳的纳米空间内[22 ,23] 。·815· 化 　学 　进 　展 第 16 卷© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net铁蛋白除可以储存铁和其他重金属离子以外 ,还可以贮存一些有机小分子物质[10 —12] 。因此完全有可能将铁蛋白进行改造 ,利用它作为合成生物来源的纳米材料。若能在它的蛋白壳空腔内组装药物 ,并使它的外蛋白壳与生物素或特定的抗体相结合 ,就可以实现药物的定向传递 ,并且可以避免产生免疫原性的问题。目前 ,作者已经成功把猪血管紧张肽和酸性多肽等药物组装到铁蛋白蛋白壳内 ,拟构建纳米多肽核2铁蛋白及研究控释多肽药物的机理 ,为研制纳米多肽药物口服剂提供理论研究依据。五、铁蛋白特殊的电泳特性与其他蛋白相比 ,铁蛋白有些很特别的理化性质 ,如非电极惰性[15 ] 和多个等电点等[24 ,25 ] 。离心沉降技术已指出马脾铁蛋白和脱铁核的马脾铁蛋白的沉降系数分别为 7518S 和 1714S。沉降系数大小与铁蛋白实际总质量成对应关系 ,而聚丙烯酰胺凝胶电泳技术却指出两者蛋白的迁移率很相似 ,与该蛋白中的铁核组成和磷铁含量高低无关[2 ] ,与铁蛋白分子尺寸大小和蛋白壳外表层电荷有关。这一现象说明 ,采用电泳技术所获得铁蛋白分子量仅是该蛋白的蛋白壳分子量 ,不包括铁核的分子量。大量实验结果已表明 ,取材于不同动植物材料所获取的铁蛋白分子量有明显差别。这一论点已经得到众多铁蛋白科学家的认可 ,但关于部分铁蛋白亚基类型 (单或双亚基)一直处于争论之中 ,尤其是鲨鱼肝铁蛋白和细菌铁蛋白[24 —28 ] 。由于铁蛋白 H 和 L 亚基之间的分子差别仅 1 —2kμ和常规电泳技术分辩率较低 ,易引起蛋白凝胶层析带之间的重叠 ,使原本应呈现出 H和L 两条凝胶层析带 ,可能只显示出单条凝胶带 ,从而误解成某些铁蛋白仅有单种类型亚基组成。电泳纯的鱼工鱼铁蛋白在等电聚胶层析带上呈现出3 种不同等电点的蛋白质 ,即使脱去占原铁核中总铁量的 20 %铁时 ,其等电点数目和 pI值不变。这些实验结果说明了铁蛋白蛋白壳外表层带有不同电荷[2 ,10 ] ,推测可能执行着不同的生理功能。MALDI2TOF质谱技术是目前准确测定铁蛋白亚基之间类型、分子量及肽指纹图谱的最佳技术之一 ,它为阐明铁蛋白同源性、亚基部分一级结构和分析血清蛋白组中铁蛋白分布等提供方便快捷分析技术[16 ] ,为拓展铁蛋白结构与功能研究提供新颖分析技术。参 考 文 献[ 1 ] Goto F , Yoshihara T , Shjgemoto N , et al . 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