Analyse moléculaire d'une protéine-kinase, PrkC, et d'une phosphatase, PrpC, impliquées dans deux processus de développement chez Bacillus subtilis

Abstract

La phosphorylation des protéines sur les résidus Ser/Thr/Tyr est d'une importance vitale dans de nombreux processus cellulaires. Mes travaux de thèse concernent la caractérisation, pour la première fois de PrkC, une Ser/Thr protéine-kinase de type eucaryote chez Bacillus subtilis. PrkC est une protéine membranaire dont l'organisation topologique est similaire à celle des récepteurs à activité kinase chez l'homme, avec un domaine extracellulaire, présumé senseur, un domaine transmembranaire unique (TMD) et un domaine kinase conservé. Grâce à l'utilisation d'un système génétique, j'ai montré que PrkC forme des dimères, le TMD et le domaine extracellulaire étant capables de promouvoir la dimérisation. En présence d'ATP, la protéine PrkC purifiée, est capable de s'autophosphoryler et de phosphoryler la protéine exogène MBP. Dans les deux cas, la phosphorylation concerne un ou plusieurs résidus thréonine. En collaboration avec Ole Jensen (Danemark), nous avons pu identifier après analyse par spectrométrie de masse en mode tandem MS/MS, huit résidus phosphorylés chez PrkC. Ainsi, quatre Thr sont localisées dans la boucle d'activation, trois Thr dans la région jouxtant la membrane et une Ser dans une région non conservée. La mutagénèse dirigée de ces résidus a montré que l'autophosphorylation de la Ser et des thréonines dans la boucle d'activation est essentielle pour l'activité kinase de PrkC. Parallèlement à ce travail, PrpC, une protéine homologue de la phosphatase humaine PP2C, a été caractérisée. La forme autophosphorylée de PrkC est déphosphorylée par PrpC. Le fait que PrkC et PrpC soient codées par deux gènes adjacents sur le chromosome et cotranscrits, suggère que ces enzymes pourraient fonctionner in vivo comme un couple kinase/phosphatase. La délétion des gènes prkC ou prpC réduit l'efficacité de la sporulation et la formation de biofilms. Une meilleure compréhension du rôle de PrkC et PrpC dans la cellule exige l'identification de leurs cibles/partenaires.Protein phosphorylation on Ser/Thr/Tyr residues plays a vital role in many cellular processes. My studies in this Thesis concerned the characterization, for the first time of PrkC, a membrane linked protein kinase in Bacillus subtilis, belonging to the super-family of Hanks kinases, predominantly found in eukaryotes. PrkC was shown to be an integral membrane protein with the topology of some receptor kinases found in humans, with an external domain presumed sensor, a single transmembrane domain (TMD) and a highly conserved kinase domain. I have shown that PrkC forms dimers with both the extracellular domain and the TMD capable of promoting dimerization. In the presence of ATP, PrkC or its catalytic domain, PrkCc, autophosphorylates in vitro and phosphorylates MBP. In both cases, phosphorylation involves one or more Thr residues. In collaboration with Ole Jensen (Danemark), we were able to identify precisely eight phosphorylated residues in PrkC by mass spectrometry. These residues were localised to specific regions of a 3D structure of PrkCc modelled on known kinase structures. Four Thr were localised to the activation loop whereas three Thr are in the juxtamembrane region, and one Ser in a non conserved region. Site directed mutagenesis of these residues confirmed that autophosphorylation of Ser214 and the threonine residues in the activation loop is essential for kinase activity. In a complementary approach, PrpC, a protein phosphatase homologue of the human PP2C family was also characterized. The autophosphorylated form of PrkC was dephosphorylated by PrpC. PrkC and PrpC are encoded by adjacent genes which are co-transcribed. These results indicate that these enzymes form a functional protein kinase/phosphatase couple. Moreover, other studies showed that mutants deleted for prkC or prpC displayed reduced biofilm formation and sporulation frequencies. A better understanding of the role of PrkC and PrpC in the cell requires identification of targets/partners.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF