Etude in vivo de l'activation d'une pro-drogue par des mycobactéries à l'aide de la RMN 1H HRMAS (analyse structurale et biochimique de OPgG de Escherichia coli, une protéine requise pour la biosynthèse des glucanes périplasmiques osmorégulés)

Abstract

L'éthionamide (ETH) est un antituberculeux de seconde ligne, très efficace dans le traitement des patients infectés par des souches de Mycobacterium tuberculosis multirésistantes aux molécules de première ligne. L'ETH est une pro-drogue, elle nécessite donc de subir un processus d'activation afin d'acquérir son activité antibiotique dirigée contre la biosynthèse de l'enveloppe cellulaire de M. tuberculosis. Une cible identifie e de l'ETH est InhA, une enzyme impliquée dans la synthèse des acides mycoliques, un constituant majeur de la paroi des mycobactéries. Un activateur de l'ETH a été identifié chez M. tuberculosis, il s'agit de la protéine EthA, une monooxygénase. La surexpression de cette protéine engendre une hypersensibilité des mycobactéries vis-à-vis de l'ETH. A l'inverse, la surexpression de EthR, un répresseur transcriptionnel de ethA, rend les bactéries résistantes à l'ETH. Dans le but de mieux appréhender le rôle de l'activateur EthA, nous avons surexprimé et partiellement purifié cette protéine. En solution, EthA forme des agrégats de hauts poids moléculaires, ce qui ne nous a pas permis d'aller plus en avant dans l'étude structurale de la protéine que nous avions envisagée. Nous avons alors utilisé une technique originale : la RMN 1H HRMAS afin de caractériser in vivo l'activation de l'ETH par des mycobactéries. Cette technique nous a permis de détecter un métabolite, ETH*, dérivé de l'ETH et formé par les mycobactéries surexprimant EthA. Le métabolite ETH* s'accumule dans les cellules tandis que deux autres métabolites de l'ETH, respectivement ses dérivés S-oxyde et alcool, sont présents uniquement dans le milieu de culture. Nous avons partiellement caractérisé, par RMN, la structure de ETH* qui comprend un cycle 2-éthyl-pyridine ainsi qu'un groupement en position 4 qui contient un atome de carbone quaternaire. La nature exacte de cette fonction exo-cyclique reste à préciser. La technique RMN 1H HRMAS nous a également permis de détecter, ex-vivo, les métabolites de l'ETH présents dans un foie d'une souris ayant reçu de l'ETH. L'ensemble de ces travaux s'inscrit dans la démarche d'une meilleure compréhension de l'activation de l'ETH chez les mycobactéries afin de concevoir in fine des versions améliorées de la drogue. Ces études ont également permis de mettre en évidence les bénéfices de l'utilisation de la RMN 1H HRMAS dans l'étude d'un processus de métabolisation in vivo. Les OPGs (Glucanes Périplasmiques Omorégulés) sont des molécules glucosidiques très largement répandues parmi les Protéobactéries. Les OPGs sont synthétisés en réponse à un environnement où l'osmolarité est faible. Leur concentration périplasmique devient alors très élevée et les OPGs peuvent représenter jusqu'à 5 % du poids sec des cellules de E. coli. Le rôle physiologique des OPGs demeure incertain mais ces molécules semblent être impliquées dans un processus d'osmoprotection et pourraient servir de signal indiquant aux bactéries d'adapter leur métabolisme aux conditions environnementales. Les OPGs jouent un rôle, direct ou indirect, dans la pathogénicité. En effet, en inhibant leur biosynthèse chez Erwinia chrysanthemi, Agrobacterium tumefasciens ou encore Pseudomonas aeruginosa, ces bactéries sont avirulentes. Les OPGs de E. coli sont des oligomères linéaires de glucose liés en -1,2 et ramifiés par des résidus de glucose en position -1,6. Ces OPGs sont substitués par des groupements phosphoglycérol, phosphoéthanolamine et succinate. Chez E. coli, deux protéines, OpgH et OpgG, sont strictement nécessaires à la biosynthèse du squelette glycosidique des OPGs. La première est une glycosyltransférase membranaire tandis que la deuxième est une protéine périplasmique dont la fonction est inconnue. Dans le but de comprendre le rôle de OpgG dans la biosynthèse des OPGs nous avons réalisé une étude structurale et biochimique de la protéine. OpgG de E. coli a été cristallisée puis sa structure résolue à 2,5 Å par diffraction des rayons X. OpgG est organisée en deux domaines formés par des feuillets . Le domaine N-terminal comprend une large cavité qui représente un site actif potentiel et présente des homologies de structure avec de nombreuses protéines reliées au métabolisme de composés glycosidiques. Le domaine C-terminal a une structure similaire à celle d'un domaine de type immunoglobuline. Nous avons ensuite investigué une potentielle interaction entre OpgG et la glycosyltransférase membranaire OpgH. Pour ce faire, une boucle périplasmique de OpgH a été clonée puis exprimée en fusion au domaine B1 de la protéine G streptococcale. L'interaction entre les deux partenaires à été étudiée par RMN et confirmée par chromatographie d'exclusion. Dans une dernière partie, nous avons optimisé les conditions expérimentales permettant d'obtenir des spectres RMN de qualité sur la protéine OpgG malgré sa masse moléculaire élevée de 56 kDa. Des résultats prometteurs ont été obtenus en utilisant des séquences de type TROSY sur la protéine OpgG triplement enrichie [2H, 15N, 13C].LILLE2-BU Santé-Recherche (593502101) / SudocSudocFranceF