Antibiotic resistance is a worldwide problem and it threatens the prevention and treatment of infections caused by different pathogens. All living organisms produce natural products including ribosomal peptides with great variety. They are widely distributed in nature and they are playing more significant role in the search of new antimicrobial compounds used as therapeutical agents. Bacteria are a prolific source of peptides many of which are antimicrobial and microbial genomes are widely believed to encode new antimicrobial peptides. Genome mining has expanded the number of families of ribosomally synthesized natural products in recent years. These In silico approaches together with molecular biology and chemical analysis aim to identify novel compounds.
In this study an unknown cyanobactin-like gene cluster was discovered by genome mining from genomes of cyanobacteria and also other bacteria. The aim of this work was to study the occurrence of the gene clusters in various bacterial genomes and the structures of novel peptides. The active biosynthesis of these peptides was tested by LCMS- and Q-TOF -analyses based on bioinformatic predictions. The production of the predicted peptides was also tested with stable sulphur isotope labelling. The aim was also to clone the genes needed for peptide biosynthesis into E. coli and to study antimicrobial activities of these peptides.
Bioinformatic analyses suggested that the gene clusters encoded 1–8 precursor peptides together with protease. The precursor peptides had conserved leader sequence (LPxQxxPVxR) and a highly variable core sequences, often encoding an even number of cysteines. The mature peptide is eventually formed from core sequence through post-translational changes in the precursor peptide. The gene cluster was present in 38 bacterial genomes representing a diverse selection of bacterial phyla including cyanobacteria, proteobacteria, actinobacteria, bacteroidetes, firmicutes and planctomycetes. Analyses of the precursor peptide core regions suggested that the products are 8–131 amino acids in length. These peptides could be divided into two groups based on their structures: They form a selection of disulphide-bridge stabilized peptides with 2–5 disulphide-bridges as well as short cationic peptides with an ?-helical structure. Surprisingly, these types of peptides are common in eukaryotes and part of the innate immune system displaying potent antimicrobial properties but very rarely reported for bacteria.
The peptides predicted from bioinformatic analysis were detected from Pseudanabaena sp. PCC 6802 using a combination of molecular biology and structural chemistry. Heterologous expression of the gene cluster from Pseudanabaena sp. PCC 6802 in E. coli confirmed that the gene cluster is active. A set of short cationic synthetic peptides with ?-helical structure predicted from Oscillatoria sp. PCC 10802, Dickeya zeae Ech1591, Vibrio nigripulchritudo SOn1, Agarivorans albus MKT 106, Roseibium sp. TrichSKD4 and Yersinia frederiksenii ATCC 33641 were shown to have potent antimicrobial activity between 0.8–100 ?g/ml. These findings prove that predicted cysteine containing peptides are produced by bacteria and some peptides from this novel family have antimicrobial activity, which might pave the way for new possible drugs derived from natural products.Antibioottiresistenssi on maailmanlaajuinen ongelma, joka uhkaa eri patogeenien aiheuttamien tautien hoitoa. Kaikki eliöt tuottavat ribosomaalisesti erilaisia pieniä peptidejä. Ne ovat laajalle levinneitä luonnossa ja niitä voidaan hyödyntää antimikrobisinä yhdisteinä lääkeaineina tai bioteknisissä sovelluksissa. Bakteerit tuottavat paljon erilaisia bioaktiivisia peptidejä, joista monet ovat antimikrobisia ja mikrobigenomien arvellaan koodaavan monia tuntemattomia antimikrobisia peptidejä. Genomilouhinta on laajentanut ribosomaalisesti tuotettujen peptidien kirjoa viime vuosina. Bioinformatiiviset menetelmät yhdessä molekyylibiologian ja kemiallisen analyysin avulla pyrkivät tunnistamaan uusia bioaktiivisia peptidejä.
Tietokannoissa julkaistuja bakteerigenomeita tutkittiin ja löydettiin uudenlainen geenijoukko, joka muistuttaa syanobaktiinien tuottogeenejä. Tuntematonta peptidiä koodaava geenijoukko löytyi syanobakteereista ja myös muista bakteereista. Työn tavoitteena oli tutkia geenijoukon esiintymistä eri bakteerien genomeissa ja niiden tuottamien peptidien mahdollisia rakenteita bioinformatiikan menetelmillä. Geenijoukon toiminta pyrittiin osoittamaan LCMS- ja Q-TOF -menetelmien avulla bioinformatiivisiin analyyseihin perustuen. Tavoitteena oli todistaa ennustettujen peptidien olemassaolo käyttämällä eri rikin isotooppeja kandidaattikannan kasvatusalustassa, jolla pyrittiin havaitsemaan kysteiiniä sisältävät peptidit. Lisäksi geenijoukon toiminta pyrittiin osoittamaan kloonaamalla peptidien tuottogeenit E. coli -bakteeriin ja tutkia peptidien antimikrobisia ominaisuuksia.
Bioinformatiivisen analyysin mukaan tämä geenijoukko koodaa 1–8 esipeptidiä ja proteaasia. Esipeptidi koostuu konservoituneesta johtosekvenssistä (LPxQxxPVxR) sekä hyvin vaihtelevasta ydinpeptidistä, jossa on usein parillinen määrä kysteiiniä. Lopullinen peptidi muodostuu ydinpeptidistä esipeptidin translaation jälkeisten muokkausreaktioiden kautta. Uuden peptidiryhmän tuottogeenit löytyivät 38 eri bakteerigenomista ja ne olivat levinneet laajalle bakteerien pääjaksojen välillä edustaen kuutta eri pääjaksoa; syanobakteerit, proteobakteerit, aktinobakteerit, bakteroidetekset, firmikuutit sekä planktomykeetit. Ydinpeptidejä tarkastelemalla havaittiin, että ne olisivat 8–131 aminohappoa pitkiä. Lisäksi peptidit voitiin jakaa kahteen eri ryhmään oletetun rakenteensa mukaan: Toisissa on 2–5 rikkisiltaa kysteiinien välillä ja osa vaikuttaisi muodostavan alfa-kierre-rakenteita. Tämän tyyppiset peptidit ovat yleisiä eukaryooteilla, mutta niitä on erittäin harvoin raportoitu bakteereista. Eukaryooteilla vastaavilla peptideillä on usein antimikrobisia ominaisuuksia ja ne ovat osana luontaista immuniteettia.
Tässä työssä osoitettiin, että bioinformatiikan avulla ennustetut peptidit löytyivät syanobakteerikannasta Pseudanabaena sp. PCC 6802 käyttäen apuna molekyylibiologiaa sekä kemiallista analytiikkaa. Ilmentämällä geenijoukkoa heterologisesti todistettiin, että työssä tutkitut uudenlaiset geenijoukot tuottavat ennustettuja peptidejä. Lisäksi havaittiin, että lyhyet alfa-kierteiset kationiset peptidit, jotka ennustettiin Oscillatoria sp. PCC 10802-, Dickeya zeae Ech1591-, Vibrio nigripulchritudo SOn1-, Agarivorans albus MKT 106-, Roseibium sp. TrichSKD4- ja Yersinia frederiksenii ATCC 33641 -kannoista, olivat antimikrobisia pitoisuuksissa 0.8–100 ?g/ml. Tämän tutkimuksen tulokset todistavat, että bakteerit tuottavat kysteiiniä sisältäviä peptidejä ja jotkut peptidit tästä uudesta peptidiryhmästä ovat antimikrobisia, joita voidaan mahdollisesti hyödyntää lähtökohtana uutta lääkettä kehiteltäessä
