Der Sitz des circadianen Schrittmachers, der das Laufverhalten der Schabe Leucophaea maderae steuert, wurde durch Läsions- und Transplantationsexperimente in der akzessorischen Medulla (aMe; Plural akzessorische Medullae, aMae) lokalisiert. Die aMe ist ein noduläres Neuropil, welches sich am frontalen, ventromedialen Rand der Medulla in den bilateralen optischen Loben befindet. Immunfärbungen gegen das Octadeca-Peptid pigment-dispersing hormon (PDH) aus Crustaceen zeigen eine dichte Innervation von PDH-immunreaktiven (PDH-ir) Zellen in der aMe. Bei Drosophila melanogaster und Leucophaea maderae exprimiert ein Grossteil der PDH-ir Zellen das Protein PERIOD, einen integralen Bestandteil des molekularen circadianen Schrittmachers (pacemaker). Darüber hinaus erfüllt die Anatomie der gefundenen PDH-ir Zellen wichtige Kriterien eines circadianen Schrittmachers. So weisen sie Projektionen in der Lamina auf und somit einen möglichen Informationsausgang zu den Komplexaugen, es besteht eine Kopplungsbahn zwischen den bilateralen aMae und es sind Ausgänge in das superiore mediane Protocerebrum vorhanden, welche für die Kontrolle des Verhaltens verantwortlich sein könnten.
Zusätzlich zu den PDH-ir Zellen wird die aMe von einer Vielzahl verschiedener Peptid- und GABA-ir Neurone innerviert. Die Verzweigungen dieser Neurone formen Subkompartimente in der aMe: ein dichtes noduläres Neuropil, dazwischen ein internoduläres Neuropil und eine „Schale“, die das noduläre und internoduläre Neuropil umgibt. Das noduläre Neuropil weist dichte Verzweigungen aus dem GABA-ir distalen Trakt auf, die vermutlich für die Lichtsynchronisation verantwortlich sind. Zusätzliche Verzweigungen von circa 25 GABA-ir Neuronen mit Somata in direkter Nähe zur aMe dienen wahrscheinlich als lokale Interneurone.
In den letzten Jahren wurden große Fortschritte in der Erforschung des molekularen Schrittmachers gemacht, aber nur wenige Informationen zu den physiologischen Eigenschaften der Schrittmacherneurone und deren Verschaltung zu einem neuronalen Netzwerk sind bekannt. In der vorliegenden Dissertation wurde eine Methode entwickelt und etabliert, welche es ermöglicht, über einen Zeitraum von Stunden bis hin zu mehreren Tagen die elektrische Aktivität von isolierten aMae aufzuzeichnen. Mit dieser Methode werden mit einer niederohmigen Saugelektrode Summenpotentiale von mehreren Neuronen simultan extrazellulär abgeleitet (multi-unit recording). Dies ermöglicht, die zeitliche Koordination der elektrischen Aktivität von Neuronen in einem Netzwerk zu untersuchen.
Das Ziel der Arbeit war die elektrophysiologische und pharmakologische Charakterisierung der aMe und die Untersuchung, ob das neuronale Netzwerk der isolierten aMe selbstständig einen circadianen Rhythmus generiert.
Die vorliegende Dissertation gliedert sich in drei Kapitel:
Kapitel I: Pigment-dispersing factor and GABA synchronisieren Zellen der isolierten circadianen Uhr der Schabe Leucophaea maderae
Extrazelluläre Langzeitableitungen von Summenpotentialen von isolierten aMae der Schabe Leucophaea maderae zeigten, dass die Mehrzahl der abgeleiteten Neurone spontanaktiv Aktionspotentiale mit sehr regelmäßigen Intervallen im Millisekundenbereich generieren. Diese Regelmäßigkeit wird wahrscheinlich durch Membranpotentialoszillationen mit ultradianen Periodenlängen verursacht. Die meisten Neurone in der aMe sind zu Ensembles phasengleich gekoppelt und generieren simultan Aktionspotentiale mit gleichen Intervallen (Periodenlängen) und zu gleichen Zeitpunkten (Phasenlage). Verschiedene Ensembles von Neuronen generieren unterschiedliche Periodenlängen und Phasenlagen.
Die Effekte der Applikationen des inhibitorischen Neurotransmitters GABA und des Chloridkanal Blockers Picrotoxin, welcher reproduzierbar GABA-Inhibitionen aufhob, auf die zeitliche Koordination der elektrischen Aktivität, lassen vermuten, dass die neuronalen Ensembles mittels Synchronisation durch GABAerge Interneuronen gebildet werden. Die Phasenlage unterschiedlicher Ensembles wiederum kann durch Applikation von pigment-dispersing factor (PDF) synchronisiert werden (das Peptid PDF der Insekten ist homolog zu dem PDH der Crustaceen). Aus den Daten geht hervor, dass diese Phasenkopplung wahrscheinlich aus einer Inhibition der GABAergen Interneurone durch PDF resultiert.
Diese Daten lassen vermuten, dass die Kontrolle der Phasenlage von ultradianen Aktionspotentialoszillationen ein wichtiger Bestandteil der Funktionsweise des circadianen Netzwerks ist.
Offensichtlich wird diese Kontrolle der Phasenlage nicht ausschließlich über chemische Synapsen vermittelt. Die vollständige Blockade der synaptischen Übertragung durch die Entfernung extrazellulären Calciums führte zu einer Erhöhung der elektrischen Aktivität, wahrscheinlich durch den Verlust von inhibitorischen Eingängen auf spontanaktive Zellen, aber nicht zum Verlust von koordinierten Phasenbeziehungen. Die Phasenlage wurde lediglich von null Phasenunterschied zu einer neuen konstanten Phasenbeziehung verschoben.
Kapitel II: Elektrische Synapsen zwischen Neuronen der akzessorischen Medulla scheinen circadiane Schrittmacherzellen der Schabe Leucophaea maderae zu synchronisieren
Im ersten Kapitel wurde gezeigt, dass GABAerge synaptische Interaktionen zur Bildung neuronalen Ensembles führen. Während alle Neurone eines Ensembles mit der gleichen Phasenlage und gleicher Periodenlänge Aktionspotentiale generieren, zeigen unterschiedliche Ensembles unterschiedliche Periodenlängen und Phasenlagen. Allerdings führt die Blockade von synaptischer Übertragung nicht zu einem völligen Verlust von synchronisierten Aktionspotentialoszillationen, sondern zu einem graduellen Verschieben der Phasenlagen, bis hin zu einem konstanten Phasenunterschied. Daraus lässt sich schließen, dass zusätzliche Synchronisationswege in der aMe eine wichtige Rolle spielen, welche nicht von chemischen Synapsen getragen werden. Um zu untersuchen, ob elektrische Synapsen (gap junctions) an dieser Synchronisation beteiligt sind, verwendeten wir die aus Vertebraten bekannten gap junction Blocker Halothane, Octanol und Carbenoxolon (CBX). Die Effekte der Applikation von verschiedenen gap junction Blockern in Gegenwart und Abwesenheit von synaptischer Übertragung in der aMe, lassen darauf schließen, dass verschiedene Populationen von aMe Interneuronen durch gap junctions zu einer stabilen Phasendifferenz synchronisiert werden. Diese Synchronisation schafft die notwendige Voraussetzung für die synaptische Kopplung zu Ensembles von aMe Neuronen mit identischer Phasenlage.
Kapitel III: Extrazelluläre Langzeitableitungen vom circadianen Schrittmacherzentrum der Schabe Leucophaea maderae offenbaren circadiane wie auch ultradiane Rhythmen
Die elektrische Aktivität der isolierten aMe konnte im Dauerdunkel extrazellulär bis zu fünf Tagen gemessen werden. Bei extrazellulären Saugelektrodenableitungen, wie sie hier durchgeführt wurden ist die gemessene Frequenz unter anderem vom Synchronisationsgrad der einzelnen Neurone abhängig. Hohe Synchronisation zu identischer Phasenlage führt zu einer Verringerung der gemessenen Frequenz und umgekehrt. Da wir zeigen konnten, dass die Synchronisation von Phasenlagen und Periodenlängen ein integraler Bestandteil des aMe Netzwerkes ist, wurde das zeitliche Auftreten von definierten Frequenzmaxima unabhängig von der absoluten gemessenen Frequenz analysiert. Die gemessenen Frequenzmaxima zeigten eine signifikant höhere Verteilung in der Mitte der subjektiven Nacht. Die Untersuchung der Intervallverteilung zwischen den Frequenzmaxima ergab eine vorherrschende ultradiane Periodenlänge von circa zwei Stunden. Zusätzlich traten gehäuft Perioden auf, deren Länge ganzzahlige Vielfache von zwei Stunden waren. Die zeitliche Verteilung dieser periodisch auftretenden Frequenzmaxima, bzw. Frequenzänderungen steht in guter Korrelation zu den Zeiträumen in denen Injektionen von PDF, Allatotropin, GABA und Serotonin die Phasenlage der Lokomotion im Dauerdunkel am stärksten beeinflussen. Es lässt sich vermuten, dass die zeitliche Koordination des aMe Netzwerkes durch die Kontrolle der Phasenbeziehungen ultradianer Oszillatoren bewerkstelligt wird
