Diversity of tospoviruses

Abstract

Het bronsvlekkenvirus van de tomaat, dat in het Engels "tomato spotted wilt virus" (afgekort: TSWV) wordt genoemd, is een wereldwijd voorkomend plantepathogeen. Het veroorzaakt - met name in de tropen - veel schade aan een groot aantal gewassen. Het virus wordt uitsluitend door tripsen verspreid. Recentelijk is het virus veel aandacht gaan trekken nadat de Californische trips, Frankliniella occidentalis, ëën van de belangrijkste vectoren van dit virus, zich is gaan verspreiden over het noordelijk halfrond, en wellicht zelfs over de gehele wereld, vanuit de westelijke staten van de Verenigde Staten van Amerika.Het ontbreken van goede antisera en moleculaire informatie heeft lange tijd een goede classificatie van dit virus in de weg gestaan. Dit leidde er toe dat het virus aanvankelijk in een monotypische plantevirusgroep werd ondergebracht. Op grond van morfologische eigenschappen, wijze van overdracht en genoomstructuur is het virus thans ondergebracht bij de Bunyaviridae, een grote familie van diervirussen die biologisch veelal door tal van insecten en teken overgebracht worden. Vanwege het afwijkend gastheerbereik (planten in plaats van dieren) is TSWV binnen deze familie in een apart genus (Tospovirus) ondergebracht.De virusdeeltjes hebben een diameter van 70 tot 110 nm. Zij bestaan uit drie nucleocapsiden omgeven door een lipidemembraan. Deze membraan bevat twee viraal gecodeerde glycoproteinen, Gl en G2, genoemd. Het genoom bestaat uit drie enkelstrengs lineaire RNA segmenten, die S (small), M (medium) en L (large) RNA worden genoemd en met het nucleocapside eiwit de drie nucleocapsiden vormen.Op grond van het grote waardplantenbereik van TSWV en het vermogen te worden overgebracht door verschillende tripssoorten mag verwacht worden dat er een grote variatie tussen verschillende isolaten van dit virus kan bestaan. Tot voorkort was het niet mogelijk om de diverse isolaten op welke manier dan ook te onderscheiden. Dit proefschrift beschrijft een studie waarin het onderscheiden en classificeren van TSWV isolaten centraal stond. Kennis van de variabele eigenschappen waarin TSWV isolaten kunnen verschillen is niet alleen louter van taxonomisch belang maar ook essentieel om tot een gerichte en verantwoorde bestrijding van het virus te komen, zijn epidemiologie te leren kennen en over de juiste toetsen te kunnen beschikken in de veredeling van resistente gewassen.Allereerst is er een analyse gemaakt van een twintigtal verschillende TSWV isolaten, gebruikmakend van een polyklonaal antiserurn dat bereid was tegen gezuiverde nucleocapside-eiwit (N) preparaten van een TSWV-isolaat uit Brazilië (BR-01), en twee monoklonale antisera tegen ditzelfde eiwit. Uit deze studie bleek (Hoofdstuk 2) dat de getoetste isolaten in twee serogroepen uiteen vielen. Zestien van de twintig isolaten vertoonden eenzelfde reactie met de gebruikte antilichamen (serogroep I). De overige vier isolaten reageerden slechts zwak met het BR-01 antiserum. Twee van deze isolaten reageerden met geen van beide monoklonalen, de twee andere slechts met een van beiden. Deze vier isolaten werden in een tweede serogroep (serogroep II) met twee verschillende serotypen, I en II, ondergebracht. De zestien serogroep I isolaten die met BR-01 anti-N-serum reageerden, worden - omdat de meeste in het veld op tomaten en peper zijn gevonden - verder als isolaten van TSWV aangeduid.In het derde hoofdstuk worden de resultaten van een cytopathologische -studie aan een dertigtal TSWV isolaten beschreven. Dunne weefselcoupes van geïnfecteerd plantemateriaal werden bestudeerd door middel van elektronenmicroscopie en immunogoud analyse. Tussen de verschillende isolaten werden in cytopathologisch opzicht geen principiële verschillen gevonden. Naast de virusdeeltjes die meestal in clusters in de cisternae van het endoplasmatisch reticulum van geïnfecteerde cellen voorkomen, worden in het cytoplasma ook elektronenmicroscopisch dichte aggregaten en fibrillaire structuren aangetroffen. De aggregaten bleken ondermeer uit nucleocapside-eiwit te bestaan, terwijl de fibrillaire structuren, die in verschillende vormen voorkomen, specifiek reageerden met antisera tegen het non-structurele eiwit (NSs) dat door het S RNA gecodeerd wordt.In het vierde hoofdstuk zijn de biologische eigenschappen beschreven van een sterk afwijkend Nederlands isolaat (NL-07), dat echter grote overeenkomst vertoont met een isolaat dat in de Verenigde Staten van Amerika door Law en Moyer (J. Gen. Virol. 71: 933- 938, 1990) is beschreven. Dit Nederlandse isolaat reageerde totaal niet met het voor serogroep I of serogroep II specifieke antiserum. Op grond van deze serologische resultaten wordt dit isolaat als een nieuw tospovirus beschouwd, waarvoor de naam "Impatiens necrotic spot virus" (INSV) is gekozen. Dit virus verschilt echter niet alleen serologisch van serogroep I en II, maar ook in haar reactie op waardplanten. INSV geeft vaak systemische infecties op bepaalde plantesoorten die als sierplanten, bijv. Impatiens , gebruikt worden. Echter de meeste nachtschadeachtigen die vaak systemisch met TSWV reageren geven na infectie met INSV locale necrotische vlekjes op het geïnoculeerde blad. In een gering aantal soorten breiden deze infecties zich uit tot plantedelen die aan het geïnoculeerde blad grenzen, waarna de plant meestal afsterft.De biologische en de moleculaire eigenschappen van het Braziliaanse isolaat BR-03, en het Zuid-Afrikaanse isolaat SA-05, die als vertegenwoordigers van de beide serotypen in serogroup II worden beschouwd, worden in het vijfde hoofstuk beschreven. De reacties van deze isolaten verschillen op diverse waardplanten in principe niet van die, welke door de serogroep I virussen veroorzaakt worden. Ook met betrekking tot een aantal andere eigenschappen, zoals de verhouding waarin de nucleocapsiden onderling voorkomen, werden geen verschillen gevonden die voor classificatie bruikbaar waren. De conclusies zoals die op grond van serologische analyses in het tweede hoofdstuk zijn getrokken, werden bevestigd in experimenten, waarin antisera tegen het nucleocapside-eiwit van elk van deze isolaten gebruikt werden. In deze studie waarin genoemde isolaten, maar ook andere serotype I- en II isolaten werden getoetst, konden deze serotypen duidelijk van elkaar onderscheiden worden. Bovendien toonden Northern blot hybridisatie experimenten aan dat het RNA van deze isolaten in geringe mate met nucleïnezuur probes van BR-01 reageerden. Ook onderling bleek het RNA van de serotype I isolaten duidelijk van de serotype II isolaten te verschillen. Op grond van deze bevindingen werd gesuggereerd dat de virussen die tot een van deze serotypen behoren als vertegenwoordigers van een aparte virussoort moet worden aangemerkt.In het laatste hoofdstuk (Chapter 6) wordt aangetoond dat de twee verschillende serotypen uit serogroep II op basis van de verschillen tussen de nucleocapside eiwitten inderdaad als twee verschillende virussoorten beschouwd moeten worden. Vergelijking van de nucleotidenvolgorden toonde aan dat er tussen de nucleocapside-eiwit (N) genen van de isolaten uit serogroup I (TSWV) en III (INSV) een homologie van slechts 55.9% bestaat. Voor de serogroep II isolaten vertoont dit gen meer homologie met de N genen van de serogroep I isolaten (75% homologie) dan met die van de serogroep III isolaten (56% homologie). Terwijl de isolaten uit serogroep I of uit III onderling nagenoeg dezelfde N gen sequentie blijken te hebben, wijken die van de serogroep II isolaten sterk van elkaar af (82% homologie). Deze resultaten ondersteunen de conclusie dat de serotype I en II isolaten als twee verschillende virussoorten opgevat moeten worden. Voor deze twee nieuwe virussoorten worden de namen "tomato chlorotic spot virus" (TCSV, serotype I) en "groundnut ringspot virus" (GRSV, serotype II) voorgesteld.Als resultaat van deze studie kunnen we naast TSWV thans drie additionele soorten in het genus Tospovirus onderscheiden. Hoogstwaarschijnlijk zullen andere afwijkende isolaten die tot nu toe door andere auteurs minder diepgaand zijn bestudeerd, zoals het groundnut bud necrosis virus en het watermelon silver mottle virus te zijnertijd ook als aparte soorten aan dit genus toegevoegd kunnen worden.</p