Avances en el estudio de biomarcadores de inflamación en saliva de cerdo

Abstract

La sepsis es una condición grave y potencialmente mortal caracterizada por una respuesta inflamatoria sistémica desencadenada por un agente infeccioso que puede llevar finalmente a la disfunción orgánica e incluso a la muerte. Los biomarcadores pueden permitir una intervención más temprana y un mejor tratamiento de la sepsis, mejorando los resultados de salud y el bienestar de los pacientes, y reduciendo el desarrollo de resistencia a los antibióticos y las pérdidas económicas. En medicina humana, varios biomarcadores se utilizan rutinariamente para detectar infecciones bacterianas y guiar en el uso responsable de antibióticos, como la procalcitonina. En medicina veterinaria, a pesar de que las enfermedades inflamatorias e infecciosas generan muchos problemas de salud y pérdidas económicas en las granjas, este campo está poco explorado. Esta tesis de doctorado busca contribuir al campo del diagnóstico y la caracterización de la sepsis en cerdos profundizando y ampliando nuestra comprensión de los biomarcadores inflamatorios, su comportamiento y su relevancia en la sepsis en cerdos. Los objetivos específicos son los siguientes: • Objetivo 1: Investigación bibliográfica sobre la sepsis y los biomarcadores más comunes utilizados para diagnosticar y monitorearla en la medicina veterinaria. • Objetivo 2: Identificación de nuevos biomarcadores potenciales utilizando técnicas de proteómica. • Objetivo 3: Validación y medición de varios biomarcadores de inflamación, estrés oxidativo, bienestar y daño muscular, con posibles aplicaciones en la inflamación séptica y el estudio de sus posibles cambios en la sepsis y otras condiciones. • Objetivo 4: Desarrollo y validación de nuevos ensayos para diagnosticar sepsis: procalcitonina y presepsina. Para alcanzar estos objetivos, se utilizó la siguiente metodología: • Las muestras de cerdo se recolectaron principalmente de saliva, con esponjas de polipropileno; también se recolectó sangre mediante punción de la vena yugular. • Se realizaron análisis proteómicos de las muestras de cerdo utilizando técnicas basadas en gel y sin gel, incluyendo SDS-page y espectrometría de masas. • Se emplearon varios métodos como kits comerciales automatizados, ELISAs y ensayos quimioluminiscentes para analizar los biomarcadores estudiados, abarcando estrés, inflamación, estado redox y daño muscular. • Se desarrollaron anticuerpos policlonales y monoclonales para la detección de dos biomarcadores de sepsis, procalcitonina y presepsina. Los anticuerpos policlonales se generaron mediante la inmunización de un conejo y una cabra, mientras que los monoclonales se produjeron utilizando ratones como la especie elegida para la inmunización, con la posterior producción de hibridomas. • La tecnología utilizada para el desarrollo de los ensayos con los anticuerpos previamente mencionados fue AlphaLISA, que tiene diversas ventajas, como el uso mínimo de muestra y la ausencia de pasos de lavado. En resumen, esta investigación contribuyó al desarrollo de herramientas valiosas para el diagnóstico de infecciones y condiciones inflamatorias, con un enfoque integral que involucró la producción de anticuerpos, la recolección de muestras, el desarrollo de ensayos y el análisis de biomarcadores. Las conclusiones específicas de esta tesis de doctorado son: 1. Los biomarcadores con potencial en el diagnóstico y monitorización de la sepsis pueden clasificarse en tres categorías principales: (1) proteínas de fase aguda y citocinas, que han sido tradicionalmente utilizadas en medicina veterinaria para evaluar la inflamación; (2) PCT, PSE y otras proteínas más recientes que son más específicas de infecciones bacterianas; y (3) otros marcadores que pueden proporcionar información complementaria. 2. En los estudios proteómicos, la saliva y el suero mostraron patrones diferentes en respuesta a la inflamación séptica en un modelo inducido por LPS y la meningitis debida a Streptococcus suis. Además, se encontraron cambios en las proteínas de la saliva en otras enfermedades sépticas, como la diarrea causada por Escherichia coli. 3. La sepsis produce cambios en los analitos salivares relacionados con estrés, estado redox, inflamación y daño muscular, lo que abre la posibilidad de utilizarlos como posibles biomarcadores para este proceso en el cerdo. En esta línea, se requieren estudios adicionales para definir la capacidad y las aplicaciones de estos biomarcadores en el diagnóstico y monitorización de la sepsis, así como establecer valores de corte precisos. 4. La procalcitonina se midió por primera vez en la saliva porcina y mostró aumentos más elevados en cerdos con diferentes patologías sépticas, como en un modelo inducido por LPS, en meningitis por Streptococcus suis y en un brote de mordedura de cola; que en procesos inflamatorios no sépticos como un modelo inducido por trementina.Sepsis is a severe and life-threatening condition characterized by a systemic inflammatory response triggered by an infectious agent that can finally lead to organ dysfunction and even death. Biomarkers can allow an earlier intervention and better treatment of sepsis, improving the health outcomes and welfare of patients, and reducing development of antibiotic resistances and economic losses. In human medicine, several biomarkers are routinely used to early detect bacterial infections and guide in antibiotic stewardship, like procalcitonin. In veterinary medicine, even though inflammatory and infectious diseases lead to many health problems and economic losses in farms, this field is poorly explored. This PhD thesis seeks to contribute to the field of sepsis diagnosis and characterization in pigs by deepen and widen our understanding of inflammatory biomarkers, their behavior, and their relevance in sepsis in pigs. The specific objectives are: • Objective 1. Bibliographic research about sepsis and the current most common biomarkers used to diagnose and monitor it in veterinary medicine. • Objective 2. Identification of new potential biomarkers using proteomics techniques. • Objective 3. Validation and measurement of various biomarkers of inflammation, oxidative stress, welfare, or muscle damage, with potential application in septic inflammation and study of their possible changes in sepsis and other conditions. • Objective 4. Development and validation of new assays to diagnose sepsis: procalcitonin and presepsin. To this end, the methods that were used were: • Samples from pigs were collected mainly in saliva, using polypropylene sponges. Saliva is considered a non-invasive sample that ensures welfare in pigs and allows for serial sample collections, even in the same day, and by non-trained personnel. Blood was collected with comparative purposes, through jugular vein puncture. • Proteomic gel-based and gel-free analyses of pig samples were conducted to identify new biomarkers, including SDS-page and mass spectrometry. • Various methods, including automated commercial kits, ELISA, and chemiluminescent immunoassays, were employed to analyze the studied biomarkers, covering stress, inflammation, redox status, and muscle damage. • Polyclonal and monoclonal antibodies for the detection of two sepsis biomarkers, procalcitonin and presepsin, were developed: polyclonal antibodies through immunization of a rabbit and a goat; and monoclonal antibodies using mice as the chosen species for immunization, with the subsequent production of hybridomas. • The technology used for assays development with the previous antibodies was AlphaLISA, that has several advantages such as minimal sample usage and no need for washing steps.Overall, this research contributed to the development of valuable tools for diagnosing infections and inflammatory conditions, with a comprehensive approach that involved antibody production, sample collection, assay development, and biomarker analysis. The specific conclusions of this PhD these are: 1. The biomarkers with a potential in the diagnosis and monitoring of sepsis can be classified into three main categories: (1) acute phase proteins and cytokines, which have been traditionally used in veterinary medicine for evaluation of inflammation; (2) PCT, PSE, and other more recent proteins that are more specific of bacterial infections; and (3) other markers that can provide complementary information. 2. In the proteomic studies, saliva and serum showed different patterns in response to septic inflammation in a model induced by LPS and meningitis due to Streptococcus suis. In addition, changes in proteins in saliva were found in other septic diseases, such as diarrhoea caused by Escherichia coli. . Sepsis produces changes in salivary analytes related to stress, redox status, inflammation, and muscle damage, which opens the possibility of using them as potential biomarkers for this process in the pig. In this line, further studies are necessary to define the ability and applications of these biomarkers to diagnose and monitor sepsis, as well as establish accurate cut-off values. 4. Procalcitonin was measured for the first time in porcine saliva and showed higher increases in pigs in different septic conditions, such as in an LPS-induced model, Streptococcus suis meningitis, and a tail-biting outbreak, than in non-septic inflammatory processes like a turpentine-induced model

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