Sompong, Sansenya

Suranaree University of Technology Intellectual Repository

        สมพงษ ์ แสนเสนยา :การศึกษาหนา้ท่ีและโครงสร้างของเอนไซมเ์บตาไกลโคซิเดสจากพืชต่อความจ าเพาะกบัสับสเตรท (FUNCTIONAL AND STRUCTURAL STUDIES OF PLANT β-GLYCOSIDASE SUBSTRATE SPECIFICITY)  อาจารยท่ี์ปรึกษา : ศาสตราจารย ์ดร.เจมส์ เกตุทตั-คาร์นส์, 137 หนา้    ผลึกของเอนไซม ์Os4BGlu12 อิสระ และเอนไซมท่ี์รวมอยูก่บัสารยบัย ั้ง 2,4-dinitrophenyl-2-deoxy-2-fluoroglucoside (DNP2FG) และ 2-deoxy-2-fluoroglucose (G2F)และเอนไซมก์ลายพนัธ์ Os4BGlu12 E179Q ท่ีรวมอยูก่บั TAG ไดถู้กผลิตข้ึน ผลึกทั้ง 4 ชนิดสามารถหกัเหรังสีเอกซเรยไ์ดค้วามละเอียดถึง 2.50 2.45 2.40 และ 3.2 องัสตรอม ตามล าดบั จากการเปรียบโครงสร้างสามมิติกบัเอนไซมช์นิดอ่ืนท่ีอยูใ่นตระกูลเดียวกนัพบวา่โครงสร้างโดยรวมมีลกัษณะเหมือนกนั แต่ตรงบริเวณ  loop B ของเอนไซม์ Os4BGlu12 จะมี disulfide bridge เพิ่มข้ึนมา บริเวณเร่งปฏิกิริยาของเอนไซมมี์ลกัษณะเป็นช่องและมีความลึกประมาณ 20 องัสตรอม ตรงบริเวณท่ีลึกสุดของต า แหน่งเร่งปฏิกิริยาของเอนไซมก์บัตวัยบัย ั้ง G2F จะพบโครงรูปแบบ 4C1 chair ซ่ึงเกิดพนัธะโควาเลนทก์บักรดอะมิโนท่ีท า หนา้ท่ีเป็น nucleophile แต่ในขณะเดียวกนัตรงบริเวณเร่งปฏิกิริยาของเอนไซมก์บัตวัยบัย ั้ง DNP2FG จะพบโครงรูปแบบ 1S3 skew boat ซ่ึงสอดคลอ้งกบัโครงรูปแบบ 4H3 half-chair ในสภาวะทรานซิชนัของปฏิกิริยาการยอ่ยสลาย เม่ื อเปรียบเทียบต า แหน่ง ของกรดอะมิโนท่ีท าหนา้ท่ีเป็น nucleophile ในโครงสร้างของเอนไซม ์ Os4BGlu12 ท่ีจบัอยูก่บัตวัยบัย ั้ง G2F มีความคลา้ยคลึงกบัท่ีพบในเอนไซม ์ Sinapsis alba myrosinase มากกวา่เอนไซมใ์นกลุ่ม O-glucosidase เช่น เอนไซม ์ Os3BGlu6 หรือ เอนไซม ์ Os3BGlu7 ซ่ึงสอดคลอ้งกบัการท่ีเอนไซม ์ Os4BGlu12สามารถยอ่ยสับสเตรท  S-glycoside ได ้โดยไม่พบการยอ่ยสับสเตรท S-glycoside ในกลุ่ม  O-glucosidase ตวัอ่ืน จากการเปรียบเทียบต า  แหน่ง  aglycon biding site ของเอนไซม ์ Os4BGlu12 กบัเอนไซมต์วัอ่ืนท่ีอยูใ่นตระกูลเดียวกนัพบวา่บริเวณ aglycon ของตวัยบัย ั้ง DNP2FG และ สับสเตรท TAG ในโครงสร้างของเอนไซม ์ Os4BGlu12 ถูกลอ้มรอบดว้ยกรดอะมิโนชนิดไม่ชอบน ้า และกรดอะมิโนชนิดมีขั้วซ่ึงกรดอะมิโนเหล่าน้ีมีความแตกต่างกบักรดอะมิโนท่ีพบใน  aglycon biding site ของเอนไซมต์วัอ่ืนท่ีอยูใ่นตระกูลเดียวกนั          II  จากการ เปรียบเทียบโครงสร้างของ เอนไซม์  Os3BGlu6 และ เอนไซม ์ Os4BGlu12 กบั เอนไซม ์ Os3BGlu7 ท่ีจบักบัโอลิโกแซคคาไลด ์แสดงใหเ้ห็นวา่กรดอะมิโน  Met251 ในเอนไซม ์Os3BGlu6 กีดขวางการเขา้จบัของเซลโลโอลิโกแซคคาไลดท่ี์บริเวณ subsite +2 ขณะท่ีกรดอะมิโน His252 ในเอนไซม์  Os4BGlu12 ในบริเวณสอดคลอ้งกนัน้ีสามารถสร้างพนัธะไฮโดรเจนกบัโอลิโกแซคคาไลดไ์ดเ้หมือนกับเอนไซม ์ Os3BGlu7  การเปล่ียนกรดอะมิโน  Met251 เป็น Asn ของ เอนไซม์ กลายพนัธ์ Os3BGlu6 ท า  ใหค้่า kcat/Km  ในการยอ่ย laminaribiose เพิ่มข้ึน 15 เท่าเม่ือเทียบกบัเอนไซม ์ Os3BGlu6 ดั้งเดิม และค่า kcat/Km  เพิ่มข้ึน 9 ถึง 24 เท่าในการยอ่ย เซลโลโอลิโกแซคคาไลดท่ี์มีหน่วยความยาว  2 ถึง 5 หน่วย ในทางกลบักนัการเปล่ียนกรดอะมิโนAns245 เป็น Met ในเอนไซม ์ Os3BGlu7 ท า  ใหค้่า kcat/Km  ในการยอ่ย laminaribiose ลดลง 6.5  เท่า และ 17 ถึง 30 เท่าส า  หรับเซลโลโอลิโกแซคคาไลดท่ี์มีหน่วยความยาวสายมากกวา่ 2 หน่วย ในขณะท่ีการเปล่ียนกรดอะมิโน His252 เป็น Met ในเอนไซม ์Os4BGlu12 ค่า kcat/Km  ลดลง 2 ถึง 6 เท่า                            III  สาขาวชิาชีวเคมี ลายมือช่ือนกัศึกษา ___________________________________  ปีการศึกษา 2556 ลายมือช่ืออาจารยท่ี์ปรึกษา _________________________________          SOMPONG SANSENYA : FUNCTIONAL AND STRUCTURAL STUDIESOF PLANT β-GLYCOSIDASE SUBSTRATE SPECIFICITY.THESIS ADVISOR: PROF. JAMES R. KETUDAT-CAIRNS, Ph.D. 135 PP.GLYCOSIDE HYDROLASE FAMILY 1/β-GLUCOSIDASE/RICE/PROTEINCRYSTALLIZATION/THREE DIMENSIONAL STRUCTURE/MUTATION/KINETIC STUDYThe crystal structures of apo wild type Os4BGlu12, and its complexes with2,4-dinitrophenyl-2-deoxyl-2-fluoroglucoside (DNP2FG) and 2-deoxy-2-fluoroglucose (G2F) and the acid/base mutant Os4BGlu12 E179Q complex with TAGwere solved at 2.50, 2.45, 2.40 and 3.2 Å resolution, respectively. The overallstructure of rice Os4BGlu12 is typical of GH1 enzymes, but it contains an extradisulfide bridge in the loop B region. The active site is located at the bottom of anapproximately 20 Å deep slot-like pocket surrounded by a large surface loop. In theinnermost part of the active site (the -1 subsite), the glucose ring of the G2F in thecovalent intermediate was found in a 4C1 chair conformation, while that of thenoncovalently bound DNP2FG had a 1S3 skew boat, consistent with hydrolysis via a4H3 half-chair transition state. The 1S3 skew boat conformation of the glucose ring ofTAG also fit to the electron density best with the lowest B-factor value whencompared to the 4C1 chair conformation. The position of the catalytic nucleophile(Glu393) in the G2F structure was more similar to that of the Sinapsis albamyrosinase G2F complex than to that in covalent intermediates of other O-glucosidases, such as rice Os3BGlu6 and Os3BGlu7 β-glucosidases. This correlatedwith a significant thioglucosidase activity for Os4BGlu12, although with 200-        IVto 1200-fold lower kcat/Km values for S-glucosides than the comparable O-glucosides,while hydrolysis of S-glucosides was undetectable for Os3BGlu6 and Os3BGlu7. Theaglycones of DNP2FG and TAG were in contact with both hydrophobic and polarresidues, which had little similarity to those aglycone-binding residues in other knownGH1 β-glucosidase structures.Superimposition of the structures of Os3BGlu6 and Os4BGlu12 with those ofOs3BGlu7 bound to oligosaccharides showed that the corresponding Os3BGlu6residue, Met251, appears to block the binding of cellooligosaccharides at the +2subsite, whereas His252 in this position in Os4BGlu12 could hydrogen bond tooligosaccharides. Mutation of Os3BGlu6 Met251 to Asn resulted in a 15-foldincreased kcat/Km value for hydrolysis of laminaribiose compared to wild typeOs3BGlu6 and 9 to 24-fold increases in the kcat/Km values for cellooligosaccharideswith degrees of polymerization (DP) of 2-5. On the other hand, mutation ofOs3BGlu7 Asn245 to Met decreased the kcat/Km of hydrolysis by 6.5-fold forlaminaribiose and 17 to 30-fold for cellooligosaccharides with DP > 2, while mutationof Os4BGlu12 His252 to Met decreased the corresponding kcat/Km values 2 to 6-fold.Together, these studies have clarified the binding and hydrolysis of varioussubstrates in plant GH1 β-glucosidases.School of Biochemistry Student’s SignatureAcademic Year 2013 Advisor’s Signature

การศึกษาหน้าที่และโครงสร้างของเอนไซม์เบตาไกลโคซิเดสจากพืชต่อความจำเพาะกับสับสเตรท

http://sutir.sut.ac.th:8080/jspui/bitstream/123456789/4812/1/Abstract.pdf

การศึกษาหน้าที่และโครงสร้างของเอนไซม์เบตาไกลโคซิเดสจากพืชต่อความจำเพาะกับสับสเตรท

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Suranaree University of Technology Intellectual Repository