The neuromuscular junction (NMJ) is the site of transmission of the electrical impulses from the motor axon terminal to the muscle; the anatomical organization of this highly dynamic system also includes the perisynaptic Schwann cells (PSCs), and therefore the NMJ has to be considered structurally and functionally as a tripartite system. These non-myelinating SCs are intimately associated with the nerve muscle contact and act as dynamic partners at the synapse: they are involved in many physiological functions including the embryonic development and the maintenance of adult NMJs. Moreover, they are able to detect and reciprocally modulate synaptic activity, through the activation of muscarinin and purinergic receptors present on their surface.
In addition, non-traditional roles for PSCs in the recovery after nerve injury are being recognized. Following denervation or reduced synaptic activity, PSCs de-differentiate to an earlier developmental stage, becoming “reactive” PSCs, and start proliferating. These reactive PSCs actively participate in the process of nerve degeneration and regeneration: they undergo changes in their gene expression and acquire macrophagic-like activities, thus contributing to the removal of nerve debris as well as to the recruitment of macrophages, by releasing cytokines and chemokines. Moreover, following nerve terminals degeneration, PSCs at denervated end-plates extend long processes that induce and guide nerve regrowth.
Given the increasing incidence of non cell-autonomous and dying-back axonopathies - such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and autoimmune neuropathies - which affect predominantly motor axons terminals, it becomes very important to characterize the crosstalk between degenerating nerve terminals and adjacent PSCs at the NMJ; in particular, the identification of molecular mediators involved in PSCs activation and in nerve terminals regeneration would be crucial for the improvement of therapeutic strategies.
This is the general aim of the present thesis and with this purpose in mind, we have adopted an innovative experimental approach, alternative to the traditional cut/crush surgical model employed till now. To confine the nerve damage to the sole motor axon terminal, thus avoiding the involvement of many cell types and inflammatory mediators, we exploited our knowledge on the mechanism of action of two classes of animal presynaptic neurotoxins: α-Ltx, a pore forming toxin of the venom of black widow spiders, and some snake neurotoxins endowed with phospholipase A2 activity called SPANs. Both kinds of neurotoxins induce an acute and highly reproducible motor axon terminal degeneration, which is followed in few days by complete regeneration: thus, this model represents an appropriate and controlled system to dissect the molecular mechanisms underlying de- and re-generation of peripheral nerve terminals, and to define how PSCs contribute to such processes.
We have previously shown that nerve terminals exposed to spider or snake neurotoxins degenerate owing to calcium overload and mitochondrial failure. Here, we found that toxin-treated cultured neurons increase their mitochondrial production of hydrogen peroxide (H2O2), which can easily diffuse across membranes, thus acting as a paracrine signal on neighbouring cellS. Indeed, exposure of cultured SCs to H2O2 leads to ERK phosphorylation and to the activation of downstream pathways. The ERK signalling pathway plays a central role in controlling SCs plasticity during nerve repair in-vivo, but so far the molecular mediators responsible for its activation were unknown: neurons-derived H2O2 represents an ideal candidate for this role.
In support of this hypothesis, we observed that ERK phosphorylation is reduced in intoxicated neurons-SCs co-cultures pre-incubated with catalase - which converts H2O2 to oxygen and water -, indicating that H2O2 produced inside neurons diffuses to reach nearby SCs, contributing to ERK activation in their cytosol. ERK phosphorylation takes place also in PSCs at intoxicated NMJs in-vivo. To confirm the involvement of H2O2 in promoting nerve regeneration, we performed electrophysiological recordings and immunohistochemistry on intoxicated muscles, and we found that co-injection of catalase together with neurotoxins delays nerve regeneration, confirming the prominent role of H2O2 in promoting NMJ recovery. Injection of the MAP kinase inhibitor PD98059 also impairs nerve repair in a way similar to that observed with catalase, supporting the finding that H2O2 enhances nerve terminals regeneration through the activation of ERK pathway in PSCsLa giunzione neuromuscolare (GNM) costituisce il sito di trasmissione di un impulso elettrico dal terminale del motoneurone alla fibra muscolare; l’organizzazione strutturale di questo sistema altamente dinamico è stata ulteriormente complicata dall’aggiunta delle cellule di Schwann perisinaptiche (CSPs), dando origine al concetto di sistema tripartito. Le CSPs sono cellule di Schwann non mielinizzanti strettamente adese alla zona di contatto tra nervo e muscolo; esse partecipano attivamente a molte funzioni fisiologiche della GNM, come il suo sviluppo embrionale ma anche il corretto mantenimento di GNMs adulte. Esse sono inoltre in grado di percepire e modulare l’attività sinaptica, mediante l’attivazione di recettori muscarinici e purinergici presenti sulla loro superficie.
Studi più recenti hanno dimostrato che le CSPs sono coinvolte nei processi di recupero che hanno luogo in risposta ad un danno nervoso; in seguito a denervazione o a ridotta attività sinaptica, le CSPs de-differenziano, diventando CSPs “reattive”, ed iniziano a proliferare. Queste CSPs reattive partecipano attivamente ai processi di degenerazione e rigenerazione nervosa: esse subiscono variazioni nella loro espressione genica e acquisiscono attività simil-macrofagiche, contribuendo alla rimozione dei detriti neuronali e reclutando fagociti in seguito al rilascio di citochine e chemochine. Inoltre, in seguito alla degenerazione dei terminali nervosi, le CSPs presenti alle placche motrici denervate estendono lunghi processi citosolici in grado di indurre e guidare la ricrescita neuronale.
Considerando la crescente incidenza di malattie neurodegenerative che inizialmente interessano in maniera selettiva i terminali dei motoneuroni – quali la SLA e le neuropatie autoimmuni -, sarebbe senz’altro utile caratterizzare in maniera più approfondita il crosstalk tra terminali nervosi in degenerazione e le adiacenti CSPs. In particolare, l’identificazione di mediatori molecolari coinvolti nell’attivazione delle CSPs e nel processo di rigenerazione nervosa potrebbe rivelarsi cruciale per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.
A tale scopo, abbiamo adottato un approccio sperimentale innovativo, alternativo al cut/crush del nervo sciatico tradizionalmente utilizzato fino ad oggi. Al fine di effettuare un danno localizzato ai soli terminali nervosi, evitando il coinvolgimento di molti tipi cellulari e mediatori dell’infiammazione come accade nel corso della degenerazione Walleriana, abbiamo deciso di sfruttare il meccanismo d’azione di due classi di neurotossine presinaptiche animali: α-Latrotoxin, una tossina formante poro presente nel veleno dei ragni del genere Latrodectus, ed alcune neurotossine di serpente dotate di attività fosfolipasica, denominate SPANs. Entrambi i tipi di neurotossine inducono un’acuta e altamente riproducibile degenerazione dei terminali nervosi dei motoneuroni, seguita entro pochi giorni da una rigenerazione completa: l’azione di tali neurotossine rappresenta quindi un sistema appropriato e controllato per esaminare i meccanismi molecolari alla base della degenerazione e rigenerazione nervosa, come anche il contributo delle CSPs a tali processi.
Abbiamo precedentemente dimostrato che i terminali nervosi esposti ad α-Ltx e SPANs deegenerano a causa di un eccessivo influsso di calcio nel citosol, che a sua volta induce un danno mitocondriale. In questo lavoro, abbiamo dimostrato che neuroni primari intossicati aumentano la produzione di H2O2 a livello mitocondriale: il perossido di idrogeno è una molecola stabile e diffusibile attraverso membrane lipidiche, e potrebbe perciò agire come segnale paracrino su cellule adiacenti. Infatti, l’esposizione di cellule di Schwann (CSs) primarie in coltura a basse concentrazioni di H2O2 induce la fosforilazione di ERK, con la conseguente attivazione di pathways a valle. È stato recentemente dimostrato che la via di ERK gioca un ruolo fondamentale nel controllo della plasticità delle CSs durante la rigenerazione nervosa in vivo, ma fino ad oggi i mediatori molecolari responsabili per l’attivazione di tale pathway non sono ancora stati identificati: il perossido di idrogeno prodotto dai neuroni in degenerazione costituisce un buon candidato per tale ruolo. In supporto a tale ipotesi, abbiamo osservato che il livello di fosforilazione di ERK è ridotto in co-colture di neuroni e CSs intossicate e pre-incubate con catalasi, che converte rapidamente il perossido di idrogeno in ossigeno ed acqua: ciò conferma che il perossido di idrogeno prodotto dai neuroni diffonde effettivamente nel mezzo extracellulare fino a raggiungere le vicine CSs, nelle quali induce l’attivazione della via di ERK. Tale attivazione è riscontrata anche nelle CSPs alle GNMs intossicate in vivo. Per confermare il coinvolgimento del perossido di idrogeno nell’induzione della rigenerazione nervosa, abbiamo effettuato registrazioni elettrofisiologiche ed esperimenti di immunoistochimica, ed entrambi gli approcci sperimentali hanno dimostrato che in la somministrazione di catalasi in vivo ritarda il processo di rigenerazione nervosa in muscoli intossicati. Inoltre, il pre-trattamento con un inibitore della via di ERK - PD98059 – rallenta la il recupero dall’intossicazione con una cinetica molto simile a quella osservata in presenza di catalasi, supportando l’idea che in effetti il perossido di idrogeno promuova la rigenerazione nervosa attraverso l’attivazione della via di ERK nelle CSP
