Araujo, Marialva T. F. de

Araujo, Ronaldo de

Dias, Leonidas B.

Pinheiro, Francisco P.

Portuguese

Cadernos Espinosanos (E-Journal)

Rev. Inst. Med. trop. São Pardo 21(4) :172-177, julho-agosto,. 1979 CDU 616.988 CARACTERIZAÇÃO DO VíRUS TIMBó (BeAn 41.787), UM NOVO MEMBRO DO GRUPO DOS RHABDOVíRUS. CONTRIBUIÇÃO DO ESTUDO ULTRA-ESTRUTURAL DA INFECÇÃO EXPERIMENTAL AO CONHECIMENTO DA MORFOLOGIA E MORFOG~NESE Ronaldo de ARAUJO (1), Marialva T. F. de ARAUJO (2), F.rnncisco P. PINHEIRO (8) e Leonidas B. DIAS (4) RESUMO A inoculação experimental de camundongos albinos recém-nascidos por via intra-cere-bral com o vírus Timbó (BeAn 41. 787) permitiu documentar pela primeira vez a partícula deste vírus e catalogá-lo- no Grupo dos Rhabdovírus. O vírion tem o formato típico de bala de revólVer ("bullet sha}.Je") desse grupo taxonômico, com faoes paralelas e com ra~ ras partículas cônicas, envelope co-m projeções de superfície, pequenas ou ausentes, me-de em média 259 nm de co,mprimento, possui um núcleo· ca.psídio !de 51 nm e forma-se por brotamento na camada externa da membrana nuclear, em vesículas do retículo endoplas-mático ,e na membrana citoplasmática de neurônios, acumulando-se em mui pequena quantidade nas vesículas e· no ·espaço intercelular. INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS O vírus Timbó (BeAn 41. 787) foi isolado pela primeira vez a 27 de :abril de 1962 no Ins-tituto Evandro Chagas, Belém, Brasil, de um "pool" de coração e fígado de um lagarto Am.ei-va ameiva ariteiva capturado na floresta da Embrapa, situada nas vizinhanças de Belém por CAUSEY & COI. 3, Estudos serológicos (PI-'-NHEIRO) 7 Situam este vírus juntamente com o vírus Chaco, em um grupo denominado de Foram inoculados trinta. e seis ca:mundon-gos albinos recém-nascidos por via intracere-bral, com 0,02 ml de uma suspensão de tecido cerebral de camundongos previamente inocula-dos com o vírus Timbó (BeAn 41. 787), do esto-que do Instituto Evandro Chagas, Belém, Pará. As inoculações foram executadas no Instituto Evandro Chagas e correspondem ao Registro dre Inoculação n.O 24 do Laboratório de Micr~s-copia Eletrônica do NPRH da UFPa .. Foram sa-crificados por decaptação 3 1a,nimais por dia, td6 1.0 ao 5P dia após a inoculação: no 6.0 dia após a inoculação os animais morreram espon-taneamente. . grupo Timbó. O presente trabalho relata os achados do estudo da infecção experimental relacionados com a sugestão de que este vírus possa perten-cer ao grupo- dos Rhabdovírus, devido a suas relações S'eiológicas com o vírus Chaco. Trabalho executado no Núcleo de Patologia Regional e Higiene da Universidade Federal do Pará (NPRH) e Instituto Evandro Chagas (IEC) da Funda<.::ão Serviços Esp~ciais de Saúde Pública (FSESP) .. Integran-te de pesquisa conjunta com o Instituto de M-edicina Tropical de Ham.burgo, Alemanha, iSegundo convênio CNPq-KFA. Realizado com apoio de CNPq (Projeto SIP/02-006· do Programa dos Trópicos úmidos do CNPq), (1) Patologista Chefe da Secção de Microscopia Eletrônica do. NPRH-UFPa (2) Patologista Chefe do Laboratório de Microscopia Eletrônica do NPRH-UFPa (3) Virologista Chefe da Secção de Virologia do Instituto Evandro· Chagas (IEC) da Fundação Serviços Espe-ciais de Saúde Pública (FSESP) (4) Patologista· Chefe da Secção de Experimentação Animal do NPRH-UFPa. 172 ARAUJO, R. de; ARAUJO, M. T. F. de; PINHEIRO, F. P. & DIAS, L. B. - Caracterização do vírus Timbó (BeAn 41. 787) um novo membro do Grupo dos Rhabdovírus. Contribuição do estudo ultra-estrutural da infeci;:ão exPe;imental ao conhecimento da morfologia e morfogênese. Rev. Inst. Jlled. trop. São Paulo 21:172:.177, 1979. Para o estudo em microscopLa. eletrônica foram retirados imediata.mente após a dec~pi-tação fragm1entos cúbicos de 1 mm de extensão em cada bordo, da porção média do cérebro de dois dos três camundongos sacrificados, man-tendo-se o.s fragmentos, durant,e sua manipula-ção, imersos no líquido fixador constituído de aldeído glutárico a 2% em tampão f.osfato com pH 7,2. Após lavagem no tampão os fragmentos foram pós-fixados em tetra-óxido de ósmio a 2 % por uma hora, desidratados em alcoois de concentração crescente e i:ncluídos em Epon. Os cortes ultr,&finos foram contrastados com hidróxido de chumbo e acetato de uranila e examinados e fotografados em microscópio Sie-mens Elmisik.op 101. Foram examinados, por· tanto, um total de 10 animais, 2 para cada di,a.; o for,ceiro animal sacrificado conjuntamente em cada dia foi µtilizado, apenas paira estudo de microscopia .óptic!;t. Com_o controle ·fora:_m ,Útilizados 'camundon-gos albinos .;.éci~~llii.sciCÍ$}s"' não inoCulados com o vírus Timbó, também da criação do Instituto E'vandro Chag,as, processados de idêntica ma-neira. Em nenhum de1'es foram encontradas partículas viróticas. RESULTADOS & partículas viróticas completas são en~ centradas em neurônios, no material dos ani-mais sacrificados no 3.0 dia após a inoculação. Elas têm o formato típico de "bala de revólver" -dos Rhabdovírus .e estão situadas: 1. em áreas de dilatação- do espaço perinuclear; 2. em ve-sículas citoplasmáticas associadas ao retículo endoplasmático;' 3. na membrana citoplasmá-tica e, 4. em número muito menor, no espaço intercelular. O maior número delas está situa-do nas vesículas citopl,ashláticas. & únicas :alterações celulares diretamente relacionadas com a presença do vírus são a presença de enormes vesículas citoplasmáti-cas e_ a dilatação do espaço perinuclear. VIRUS TIMBÓ 11 10 9 ,,,8 21 ,Q7 t ~6 '" "O 5 o ~ "' E4 ,::, z;i 2 (52 partículas) Comprimento Médio: 259 nm Diâmetro Médio: 51 nm i' 1 f--~----1 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 Comprimento das Partículas (nm) Fig. 1 Distribuição do comprimento de 52 partículas do vírus Tímbó (BeAn 41.787), Mensurações efetuadas em cortes ultra-finos de cérebro de camundongos experimentalmente infectados, apenas em particulas apanhad_as «in totum» nos cortes. O v1r10n apresenta-faces paralelas (Fig. 2 e 3) exceto em duas electro-micrografias (Fig. 3A e 3C) onde é possível perceber formato dis-eretamente cônico. O ,envelope, nos cortes bem-orientados, é contínuo com as membranas li-· mitantes ou está ligado ia elas por delicados fi-173 ARAU,JO, R . \lt•; ARA1JJO, M. T, F. d e : PINUETRO, li". P . &. DIAS, L . B . - C:U'a<:tt'-r lt.a<:llo do t·ir us T lmbó (8('>.An 41..787) um novo n1cmbro 11,, Or OJ)o doa R lmbdot·h•ua . Coutrlhulr.;fto dú ti<tu,lo ultra-ci.trulurl'll da il)f..,-e<;iio cxpe;imcntal 1:u:, oonhooinl,.·nt.o da mor fologia •· morrog,j1wis•· . ll('\' . ln.st. .Mt·d. tr◄,11 . :-:no 1111ulo i l : J72•l77, 1979. lamentos f1llformes (Fig. 3B). As projeções de superfície são inaparentes nas partículas s itua-das den tro de vesículas e bem evident.es nas acumuladas no Interstício. Os limites do enve-) ..... . 1"!' • • ' . l<>pe são bem definidos porém com baixa ele• trondensidade, o que os torna pouco evidentes ao exame com os menores aumentos. ~ ·! t V ~ ' ';V ~ F ig . 2 - A) Pat•ttculafJ d n \'lru$ Ti'l'l)l>ó ant eapa~O 1>e rltrnclN1.t· (E} dila.tado em ,•olla de m"l<:ll·O ( N) de u,•un)oio. Notar a p:re.ser1~a <I..: g rariltess ,·t·;;iet1Jas intr1H:lto_1>!a:smátiCO.!S (V) 1:,mh<-m ooot~·udr.• partieull\8, Aum('nto fln{ll: 34.000 X. B) Par tículas ;lo t ·irws 'l'imbó e 111 n•.i<iculaa de re ticulo .~ndoplai:on ,i..Uoo. Notor a.a r!,nu'M Nn e.V• <>u cm cY:. (s<;t .. i .!() (t,-1 ~ll·tkUl:):,; Uttidu:; pela l)M e. Amncnto fi nal : 46 .000 X. O cerne ("core"J do vírion exibe altemãncia regular de áreas de menor, com âreas de maior eletrondensidade, com aspecto catenular nos grandes aumentos (Fig. 3B). As mensurações efetuadas em 52 partículas vlrótlcas (Fig. 1) most.rarn um comprimen to médio de 259 nm, com uma, variação entre 141· 345 nrn e o núcleo capsídto com um. diâmetro 174 A.RAUJ O. R. du; ARAUJ O. M. T . F, d(' : l :>tN íllU RO, F . J?, «. .OlAS, V. B , - Caract•·•rizatàol do ,· lr\l.'S 'l'im hó (BcAn •U .7S7) . um novo nw rnhr'<, •I<> Grupu dos Rhabdovirus. Contr llm ldto rlo f'a t.udo \1ltr(l•e:stn1turnl d.:t i nf"'Cl:Ao <'Xr>N·lnwnt:lJ M • ú(fll h,,cimc:nto da nun ·!ologi:'l " m<>rl'úgt•n,•:se-. .tt,•l· . h •s t . , r1.•cl. tro1) . Slo l:";rnlv 21 : )72-177, 1979. médio de 51 nm, com uma var iação entre 30,72 nm. Foram medidas apenas as partículas apa-nhadas integra lmente no.s cortes. Dezesseis das par t.iculas medidas (30,7%) têm ta manho si-tuado en tre 290-320 nm. li°ig . 3 - A) Ptt rtkulM do ,·1t'I),; T lmh6 n o lnter~tlci◊ CP) " ,:,m ves-icuto iutra-citopl a.a-m1íllN1, "~Ul eorn ronntito cüntco (.-u-ta ). Aumi;:nt.() filH'II : a5. 000 X. B) Grande a umento d,~ Ulllll 1,ar'llcula. mostrando s ua u nião à n.1~mbrana da ,·~ ieula int ra--eltopl::ismátt<:a ))f !I' dc•lic11doa fi lamenloa. At1mf>nto final : 100 .000 X. C) Pa l'tkuhu~ em h rot:mw ntf• ••m \'<•~i. c:ul:il'I lntl'a-clt.opl:i.!!-m:1.tlca.'l dt> neurónio~, um/\ .:t,~,:.~ (~,~ta) (1e ror1fü). t.◊ cüni~). Aumento tina.l: 5-1 .,t00 X . COMENTARl OS Nesta primeira documentação das partícu• los do vírus Timbó o estudo de sua morfologia e morfogênese roost.ra todas a.<; características gerais necessár ias para colocá•IO no grupo dos Rhâ bdovírus, confirmando as sugestões dos es-tudos serológicos efetuados anteriormente. Quanto à mortogênese, o virus T imbó pa-rece par t.!lhar tanto das caracter i.stlcas da Imensa maior ia. dos Rhabdovírus de or igem animal (que se formam por brotamento a par-)75 ARAUJO, R. de; ARAUJO, M. T. F. de; PINHEIRO, F. P . .& DIAS, L. B. - Caracterizaçfí.o do vírus Timbó (BeAn 41. 787), um novo membro do Grupo d-os Rhabdovirus. Contribuição do e.studo ultra-estrutural 'da infecção experimental ao conhecimento da morfologia e morfogênese. Rev. lnst. l\Ied. trop. São Paulo 21:172-177, 1979. tir da membrana citoplasmática) como das ca-racterísticas das duas exceções à esta regra (o Vírus da raiva e o vírus Klamath que tem bro-tamento intracelular) (MURPHY & col.) •, pois fói possível identificar brotamento em ambas as localizações cita das com predomínio do nú-mero de partículas com brotamento intrace-lular. Outra característica morfogenética do Tim-bó comum com o- Klamath é o fato de ambos aPvesentarem brotMnento a partir da lamela externa da membrana nuclear. Enquanto, en-tretanto isto· constitui a exceção para o Kla-math (MURPHY & cal.) •, para o vírus Tim-bó é bem expressivo o número de partíieulas si-tuadas em espaço perinucliear dilatado. Deve-.Se acrescentar ainda que muitas das vesículas citoplasmáticas que mostram brotamento de partículas, dada sua proximidade com o nú-cleo, podem constituir projeções deste espaço · perinucleair dilatado que a incidência do corte isola no selo do citoplasma. A citopatologia das ~élulas que mostram . partículas viróticas em brotamento é domi-nada pela presença de enormes vesículas in-tracitoPiasmáticas originadas ou em retículo endoplasmático ou do espaço• perinuclear dila-tado. Não foram detectadas inclusões viróticas ("vírus matrix") às proximidades destas vesí-culas. Estes achados superpõem-se aos descritos por KARABATSOS ,& cal. 4 em materLa..l infec-tardo com o vírus Kwatta. O local de acúmulo dos vírions não pode ser definido com clareza em nosso material _pois em todos os Cortes há uffi número muito peque-no de partículas documentadas; há, entretan-to, predominância _das partículas - geralmen-te em número não maior que cinco - nas ve-sículas intra-citoplasmáticas. As mensurações do vírlon do vírus Timbó permite catalogá-lo entre os Rhabdovirus de m*ior dimensão: a média quie encontramos (259 nm) é idêntica 4 descrits, por KARABAT-sds ,& col. 4 para o vírus Navarro, sendo entre-tal}to a variação do' tamanho do vírus Timbó (141-345 nm) bem maior. O fato de que mais do que 30 % das partículas mensuradas têm um comprimento que excede 290 nm confirm,a, o g·rande tamanho deste vírus. O núcleo-capsídio tem em média 51 nm e também apresenta uma a~pla Variação de sua espessura (30-72 nm). Só foram medidas partículas 1apanhadas "in to-tµm" nos cortes, isto é, aquelas nas quais foi 17,6 possível identificar a extremidade convexa e a extremidade plana .. Não foi executado controle especial dos aumentos indicados pelo microscó• pio: apenas os ajustes de centragem habituais. O envelope do vírus Timbó não difere mar: cadamente do dos outros Rhabdovírus conhe-cidos: a pouca precisão do contorno pode ser devida à falta de impregnação. Já projeções de superfície estão predominantemente ausentes. O cerne virótico· também segue as caracte-rísticas gerais do grupo dos Rhabdovírus. Duas características :morfológicas do Tim-bó merecem destaque: a freqüência da presen-ça de partículas unidas. por sua extremidade plana e a de partículas de contorno cônico. O primeiro aspecto pode ser encontrado na do-cumentação de outros Rhabdovírus e é natural-mente interpretado como conseqüência do des-taque concomitante de partículas que brotaram em íntima proximidade: 1ela é referida aqui apenas pela freqüência relativamente grande com que encontramos três partículas com ·'fila-mentos comuns na extremidade (Fig. 3A e 3C) criando um desenho em Y que não visualiza-mos -em outros Rhabdovírus (Piry e Mosquei-ro) já estudados pela equipe (ARAUJO 1 e ARAUJO & col. 2). A presença de partículas cônicas, embora em pequeno número (2 em 52), lembra o ·des-crito por KEMP & cal. 15 para o vírus Kotonkan e naturalmente o vírus da febre efêmera bovi-, na. Sua freqüência entretanto é muito· pequena e a base (extremidade plana) é 1s,penas. leve. mente Ínaior do que aquela das partícul~ de lados Paralelos, o. que· sugere tratar-se apenas de um artefacto. SUM_iMARY Characteriz3.:tion of Timbo Virus (BeAn 41787), a new _member of the Rhabdovirus Group. Ul• trastructural study of morphology anel mórph~~ genesis in experimentally infected mouse braip,; Timbo Vírus. particles were first visualizeµ by thin section electron microscopy in th~ brain of experimentally inoculated Swiss albi~ no mice. It was found ,to be bullet-sha.ped, witl;l. : structural details similar to other viruses. of th~ Rhabdovirus group, but aiso budding frolll intracytoplasmic membranies, with little fr.ank cytopathology and without prominent vírus matrix. Budding was also ptominent upon the-outer lamella o-f the nuclear membriaille and ARAUJO, R. de; ARAUJO, M. T. F. de; P'.CNHEIRO, F. P. & DIAS, L. B. - Caracterização do vírus Timbó (BeAn 41. 787), um novo membro do Grupo dos Rhabdovírus. Contribuição do estudo ultra-estrutural da infecção experimental ao conhecimento da morfologia e morfogênese. Rev. Inst, 1\-led. frop. São Paulo 21:172-177, 1979. was not infrequent from plasma membranes. Few particles were found accumulating in cy-t.opla.smic vesicles and even less in intercellular space. Grossly distended ,cytoplasmic cisternae lined with ribosome.s w-ere the dominant cyto-pathology. The virion hias a mean length of ·259. nm, and a nucleocap.sid of 51 nm, with lar-ge variation in size. REFER"f:NCIAS BIBLIOGRÃFICAS 1. ARAUJO, M. _T. F. Comunicação pessoal. 2. ARAUJO, R.;DIAS, L. B.; ARAUJO, M. T. F.; PINHEIRO, F. & MOUTINHO, E. R. C. - Mio-cardite experimental em camundongos albinos por vírus Piry (BeAn 24.232). Rev. lnst. Med. trop. São Paulo 20: 102-111, 1978. 3. CAUSEY, O. R.; SHOPE, R. E. & BENSABATH, G. - Marco, Timbo and Chaco, nevly recognized arboviruses from lizards of Brazil, Am. J. Trop. Med. Hyg, 15: 239-243, 1966. 4. KARABATSOS, N.; LIPMAN, M. B.; GARRI.SON, M. S. & MONGILLO, C. A. - The i:norphology, morphogenesis and serological ._ characterization of the Rhabdoviruses Navarro, Kwatta, and Mossuril. J. Gen. Vi rol. 21: 429-433 , 1973. 5. 'KEMP, G. E.; LEE, V. H.; MOORE, D. L.: SHOPE, R. E.: CAUSEY, O. R. & MURPHY, F A. - Kotonkan, a new Rhabdovirus related to Mo-kola virus of the rabies serogroup. Amer. J. Epi-demio!. 98: 43-49, 1973. 6. MURPHY, F. A.; JOHNSON, H. N.; HARRISON, A. K. & SHOPE, R. E. Ultrastructural cha-racterization of a new member of the Rhabdovlrus Group - Klamath virus. Arch. F. g-es. Virus-forsch. 37: 323-331, 1972. 7. PINHEIRO, F. P. - _ Comunicação pessoal. Recebido para publicação em 20/10/1978. Dedicado ao Prof. Dr. Dietrich Peters, Chef,e da Secção de Virologia do Instituto de Medicina Tro-pical de Hamburgo, no ano de sua aposentadoria. 177 

Caracterização do vírus timbó (bean 41.787), um novo membro do grupo dos rhabdovírus. Contribuição do estudo ultraestrutural da infecção experimental ao conhecimento da morfologia e morfogênese

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