几丁质酶是甲壳动物顺利完成生理性蜕壳的关键功能酶.已有研究表明几丁质酶是一个多基因家族.根据甲壳动物几丁质酶保守序列设计引物,应用反转录PCR方法从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)内脏中扩增得到部分几丁质酶编码基因片段,进一步结合RACE法,克隆得到该几丁质酶完整编码序列.生物信息学分析表明其含有信号肽序列、几丁质酶催化中心序列、PEST连接区和几丁质底物结合部位序列.序列比对发现其与中国对虾(ABB85237.1)、斑节对虾(AF157503.1)和日本对虾几丁质酶(BAA12287.1)具有很高的相似度

王烨

石艳

谢晓兰

陈清西

陈超琪

黄乾生

Xiamen University Institutional Repository

第 28卷 　第 3期 台 湾 海 峡 Vol. 28, 　No. 32009年 8月 JOURNAL OF OCEANOGRAPHY IN TA IWAN STRA IT Aug. , 2009收稿日期 : 2008209224基金项目 :福建省科技重点项目 (2006N0067) ;中国博士后科学基金资助项目 (20070410806)作者简介 :黄乾生 (1982～) ,男 ,博士研究生.通讯作者 :陈清西 ,男 ,教授 (博导 ) ; E2mail: chenqx@xmu. edu. cn凡纳滨对虾内脏几丁质酶基因的克隆、序列分析与结构预测黄乾生 1 ,陈超琪 2 ,谢晓兰 3 ,王　烨 1 ,石　艳 1 ,陈清西 1(1. 厦门大学生命科学学院、细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 , 福建 厦门 361005;2.北京大学城市与环境学院 ,北京 100082; 3. 泉州师范学院化学与生命科学学院 ,福建 泉州 362000)摘要 :几丁质酶是甲壳动物顺利完成生理性蜕壳的关键功能酶. 已有研究表明几丁质酶是一个多基因家族. 根据甲壳动物几丁质酶保守序列设计引物 , 应用反转录 PCR 方法从凡纳滨对虾(L itopenaeus vannam ei)内脏中扩增得到部分几丁质酶编码基因片段 ,进一步结合 RACE法 ,克隆得到该几丁质酶完整编码序列. 生物信息学分析表明其含有信号肽序列、几丁质酶催化中心序列、PEST连接区和几丁质底物结合部位序列. 序列比对发现其与中国对虾 (ABB85237. 1)、斑节对虾(AF157503. 1)和日本对虾几丁质酶 (BAA12287. 1)具有很高的相似度.关键词 :生物信息学 ;凡纳滨对虾 ;几丁质酶 ;基因克隆 ;序列比对中图分类号 : Q 356. 1 文献标识码 : A 文章编号 : 100028160 (2009) 0320355205几丁质酶 ( EC 3. 2. 1. 14)广泛分布于细菌、真菌、植物和动物中. 在高等动物中 ,发现了多种几丁质酶及几丁质酶类似蛋白. 各个几丁质酶在免疫反应中起着重要作用 [ 1 ] . 在节肢动物中 ,已报道有 18个几丁质酶及其类似蛋白基因存在于果蝇基因组中 [ 2 ] . 这些都表明几丁质酶是一个多基因的家族.在甲壳动物的生长发育过程中 ,几丁质酶起着至关重要的作用. 几丁质酶的正常表达可以保证甲壳动物顺利完成蜕壳 [ 3 ] ,而如果表达出现异常 ,则会出现蜕壳不遂等病症 ,影响其正常生长发育 ,甚至导致死亡. 蜕壳不正常还会使甲壳动物的免疫能力下降 ,病毒容易入侵. 凡纳滨对虾 (L itopenaeus vannam ei)是我国最重要的经济虾类之一 ,其养殖规模逐年增加 ,但是近年来养殖场经常爆发大规模疾病 ,导致虾大量死亡 ,造成重大经济损失. 发生疾病的主要原因是由于虾免疫能力下降 ,病毒入侵引起的.虽然几丁质酶是一个多基因家族 ,但是在凡纳滨对虾中只报道过一种几丁质酶 ( nucleotide accessionnumber: AF315689). 因此 ,我们尝试克隆新的几丁质酶 ,为进一步研究其功能提供基因信息基础.1　材料与方法1. 1　材料RNA提取试剂 Trizol购自 Invitrogen公司. Taq酶来自 Fermentas公司. M2MLV反转录酶、限制性内切酶、PMD218T载体来自 Takara宝生物公司.核酸电泳 Marker购自北京天根生物公司.胶回收试剂盒购自 OMEGA公司.其他试剂为国产分析纯.大肠杆菌 DH5α由本实验室保存.凡纳滨对虾由漳州海澄养殖场提供.1. 2　方法1. 2. 1　基因克隆 　按照 Trizol试剂说明书提取凡纳滨对虾内脏总 RNA,根据 M 2MLV反转录酶说明书将其反转成 cDNA. 从 NCB I的 genebank中搜索得到 3种甲壳动物几丁质酶 ,分别是中国对虾 ( Fenneropenaeusch inensis)、斑节对虾 ( Penaeus m onodon)、日本对虾 (M arsupenaeus japon icus). 将它们的编码序列进行序列比对 ,根据比对得到的保守序列设计引物 chi121f和 chi121 r (表 1)并克隆其基因. PCR反应体系为在 20mm3的体积里含有 2mm3 buffer、2mmol/dm3 MgCl2、0. 5μmol/dm3 引物、1mm3 cDNA模板、1U Taq酶、0. 2mmol/dm3台 湾 海 峡 28卷dNTP. 反应参数为 : 95℃预变性 3m in, 95℃变性 40 s, 58～62℃复性 40 s, 72℃延伸 1m in 50 s, 35个循环 ; 72℃延伸 7m in. PCR产物用 1%琼脂糖凝胶电泳分离.上述 PCR产物经凝胶电泳分离后 ,用 OMEGA胶回收试剂盒回收 PCR片段. 回收的 DNA与 PMD218T载体连接过夜 ,转化大肠杆菌 DH5α感受态 ,涂板培养. 挑斑 ,采用碱裂解法抽提质粒 ,通过质粒双酶切和质粒 PCR进行验证 ,选取重组子进行测序鉴定 (上海生工生物工程有限公司 ). 所测得的序列用于进一步的RACE ( cDNA末端快速扩增法 )实验.根据测得的序列设计两条引物 : GSP1和 GSP2 (表 1)用于半巢式 3′2RACE实验 ,即将引物 GSP2 /3′2Outer的扩增产物稀释成 1 /10倍后 ,再用引物 GSP1 /3′2Outer进行 PCR,将 PCR产物进行测序鉴定.表 1　克隆基因所用引物序列Tab. 1　Primer sequences for gene cloning引物名称 序列 (5′23′)chi121f ATGGTGAGCGGACGCGTTTTAGchi121 r CACCAGTAGTACTTGTCACAGTCGSP1 CGATTGACTGTACTGTGCAAGAGSP2 TCCGACCACAACTAACTCCTG3′2Outer TACCGTCGTTCCACTAGTGATTTAdap tor TACCGTCGTTCCACTAGTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTVN1. 2. 2　序列分析 　将测序所得的碱基序列用 DNAMAN软件翻译为氨基酸序列. 进一步用 Signal P 3. 0和Prosite在线工具分析其信号肽序列和功能结构序列. 通过 NCB I的 B lastP工具进行蛋白序列相似性检索.2　实验结果2. 1　保守序列扩增结果取凡纳滨对虾内脏提取 RNA反转成 cDNA ,用保守序列 chi121f / chi121 r进行扩增. 根据引物退火温度选择 3个温度摸索最适复性温度 ,发现 58℃为最佳复性温度 ,结果如图 1. 扩增得到一条约 1 448bp的条带 ,将该条带克隆到 PMD218T载体中 ,并测序.2. 2　3′2RACE扩增结果根据上步 1 448bp序列设计 RACE引物 GSP1和 GSP2,用引物 GSP2 /3′2Outer去扩增带 Adap tor头的cDNA. 扩增产物 10倍稀释后 ,用 GSP1 /3′2Outer进一步扩增 ,得到如图 2所示的两条带 ,分别约为 800、400bp. 将这两条带都克隆到 PMD218T载体中进行测序分析.·653·　3期 黄乾生等 :凡纳滨对虾内脏几丁质酶基因的克隆、序列分析与结构预测将测序所得 800bp和 400bp序列分别与 1 448bp的条带进行拼接. 发现 400bp的条带可以与 1 448bp条带拼接. 拼接所得结果如图 3所示.2. 3　序列分析将克隆到的几丁质酶的推导氨基酸序列进行结构分析. 该编码区编码 628个氨基酸 ,预测分子量为70 558. 63Da,理论等电点为 5. 71. 去掉信号肽的成熟蛋白分子量为 68 465. 03Da,等电点为 5. 62. 通过 SignalP软件预测 ,发现前 22个氨基酸为信号肽区域. Prosite软件预测其 156～164位为几丁质酶催化活性中心 ,463～519位为几丁质结合部位. PESTfind预测其 412～440位 PEST区域.·753·台 湾 海 峡 28卷2. 4　序列同源性分析用 NCB I的 B lastP去寻找相似蛋白 ,所得结果如表 2所示. 分析发现凡纳滨对虾几丁质酶与中国对虾、斑节对虾、日本对虾几丁质酶序列相似度很高. 与昆虫来源的几丁质酶也具有较高的相似度 ,如表 2所示. 而与凡纳滨对虾已有几丁质酶 (p rotein accession number: AAN74647)相似度仅为 27% ,说明我们所获得的几丁质酶为凡纳滨对虾的一种新几丁质酶.表 2　凡纳滨对虾几丁质酶与其他物种来源几丁质酶蛋白序列相似度比较Tab. 2　Sim ilarity comparisons of L. vannam ei chitinase p rotein sequence with that of other organism s物种 蛋白获取号氨基酸序列相似度 /%分值 E值中国对虾 ( Fenneropenaeus chinensis) ABB85237. 1 0. 89 1 073 0斑节对虾 ( Penaeus m onodon) AF157503_1 0. 91 1 073 0日本对虾 (M arsupenaeus japonicus) BAA12287. 1 0. 93 975 0丽蝇蛹集金小蜂 (N asonia vitripennis) XP_001602780. 1 0. 51 1 398 2e2152赤拟谷盗 ( Tribolium castaneum ) NP_001034524. 1 0. 52 1 369 5e2149家蚕 (B om byx m ori) BAB13481. 1 0. 49 1 336 3e2145狗 (Canis fam iliaris) XP_537030. 2 0. 34 277 2e2723　讨论几丁质酶是一个多基因的家族 ,已发现的几丁质酶产生细菌都可产生多种几丁质酶 [ 4 ] . 从低等的真核生物到高等的真核生物 ,都发现了同一物种具有多种几丁质酶的现象. 已有一种凡纳滨对虾几丁质酶被克隆. 鉴于几丁质酶是一个多基因家族 ,我们尝试从凡纳滨对虾中克隆新的几丁质酶. 通过设计保守序列引物 ,结合 RACE法 ,成功地克隆到了一个新的几丁质酶. 该几丁质酶与甲壳纲中其他虾类几丁质酶具有很高的相似度 ,而与已克隆的凡纳滨对虾几丁质酶相似度很低. 该酶具有典型的几丁质酶结构特征 ,从 N端到 C端依次含有信号肽、几丁质酶催化活性中心、PEST连接区、几丁质底物结合部分 ,是一种典型的几丁质酶. 其中催化中心具有天冬氨酸、谷氨酸 ,是催化必需氨基酸 [ 5 ] . 该几丁质酶的克隆说明在凡纳滨对虾中同样存在多种几丁质酶.Tan等 (2000)研究发现斑节对虾几丁质酶 Pmchit1在虾肝胰腺和胃中表达 [ 6 ] . Pmchit1的表达具有组织和生长期特异性 ,在蜕壳前期 D (2)期表达量上升 ,表明它参与蜕壳前胃表皮几丁质的降解. 该几丁质酶同样来自虾内脏 ,其氨基酸序列与斑节对虾 ( Penaeus m onodon)几丁质酶 Pmchit1相似度高达 91%. 这说明它与Pmchit1属于同一类型的几丁质酶 ,很可能参与凡纳滨虾内脏表层几丁质的降解 ,为虾顺利蜕壳做准备. 这可以通过进一步的实验加以证实.几丁质酶与 N2acetyl2β2D2氨基葡萄糖苷酶构成几丁质酶系 ,共同催化几丁质的降解. 已经从凡纳滨对虾内脏中纯化得到 N2acetyl2β2D2氨基葡萄糖苷酶 [ 7 ] ,并发现其酶活力随着虾生长期而变化 ,变化规律与虾蜕壳周期相符 [ 8 ] . 几丁质酶活力的变化很可能与 N2acetyl2β2D2氨基葡萄糖苷酶相同. 我们将进一步尝试纯化凡纳滨对虾几丁质酶蛋白 ,研究其与对虾蜕壳的关系.参考文献 :[ 1 ]　Mayum i K, Yuriko H, A tsuko A, et al. Role of mammalian chitinases in inflammatory conditions[ J ]. Keio J Med, 2007, 56 (1) :21227.[ 2 ]　Zhu Q S, Deng Y P, Phaneendra V, et al. Computational identification of novel chitinase2like p roteins in the D rosophila m elano2gaster genome[ J ]. B ioinformatics, 2004, 20 (2) : 1612169.[ 3 ]　Funke B, Sp indler K D. Characterization of chitinase from the brine shrimp A rtem ial[ J ]. Comp B iochem Physiol, 1989, 94B (4) :·853·　3期 黄乾生等 :凡纳滨对虾内脏几丁质酶基因的克隆、序列分析与结构预测6912695.[ 4 ]　庄群川 ,王风平.豚鼠气单胞菌 CB101中几丁质酶的纯化 2鉴定及其基因克隆 [ J ].台湾海峡 , 2007, 26 (3) : 3622369.[ 5 ]　Lu Y M , Zen K C, Subbaratnam M , et al. Site2directed mutagenesis and functional analysis of active site acidic am ino acid resi2dues D142, D144 and E146 in M anduca sex ta ( tobacco hornworm ) chitinase [ J ]. Insect B iochem istry and Molecular B iology,2002, 32: 1 36921 382.[ 6 ]　Tan S H, Degnan B M , Lehnert S A. The Penaeus monodon chitinase1 gene is differentially exp ressed in the hepatopancreas dur2ing the molt cycle[ J ]. Mar B iotechnol(NY) , 2000, 2 (2) : 1262135.[ 7 ]　Xie X L, Chen Q X, L in J C, et al. Purification and some p roperties ofβ2N2Acetyl2D2glucosam inidase from p rawn ( Penaeus van2nam ei) [ J ]. Mar B iol, 2004, 146: 1432148.[ 8 ]　黄乾生 ,谢晓兰 ,石艳 ,等. 不同生长期凡纳滨对虾肝胰腺 NAGase的基本性质变化 [ J ]. 厦门大学学报 :自然科学版 ,2006, 45 (6) : 8472850.Clon ing , sequence and structure ana lysis for the chitinase genein the viscera of L itopenaeus vannam eiHUANG Q ian2sheng1 , CHEN Chao2qi2 , X I E Xiao2lan3 ,WANG Ye1 , SH I Yan1 , CHEN Q ing2xi1(1. Key Laboratory ofM inistry of Education for Cell B iology and Tumor Cell Engineering, School of L ife Sciences, XiamenUniversity, Xiamen 361005, China; 2. College of U rban and Environmental Sciences, Peking University, Beijing 100082, China;3. Department of B iology, Quanzhou Normal University, Quanzhou 362000, China)Ab s trac t: Chitinase is the key enzyme in the molting of crustacean. It has been reported that chitinases are multi2gene fam ily. A pair of p rimers was designed according to the conserved nucleotides of chitinases and used to clonepartial chitinase cDNA by RT2PCR methods. Then, by RACE ( rap id amp lification of cDNA ends) technology a fulllength cDNA of chitinase was obtained. The deduced p rotein sequence was analyzed with bioinformaticswhich showsthat the p roteins contained signal pep tide, chitinase catalytic domain, PEST linker and chitin binding domain. It isfound that high sequence sim ilarity existed among the chitinases of Fenneropenaeus ch inensis (ABB85237. 1 ) ,Penaeus m onodon (AF157503. 1) and M a rsupenaeus japon icus (BAA12287. 1).Key wo rd s: bioinformatics; L itopenaeus vannam ei; chitinase; gene cloning; sequence comparison(责任编辑 :郭水伙 )·953·

凡纳滨对虾内脏几丁质酶基因的克隆、序列分析与结构预测

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/19804/%e5%87%a1%e7%ba%b3%e6%bb%a8%e5%af%b9%e8%99%be%e5%86%85%e8%84%8f%e5%87%a0%e4%b8%81%e8%b4%a8%e9%85%b6%e5%9f%ba%e5%9b%a0%e7%9a%84%e5%85%8b%e9%9a%86%e3%80%81%e5%ba%8f%e5%88%97%e5%88%86%e6%9e%90%e4%b8%8e%e7%bb%93%e6%9e%84%e9%a2%84%e6%b5%8b.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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