Functional Impact of the Autophagy Lysosomal Pathway in Neurodevelopment and Neuroprotection

Abstract

Proteinet ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCHL1) tilhører en familie av enzymer som hydrolyserer ubiquitin. Enzymet uttrykkes sterkt i hjernen og spesielt i nevroner, men dens primære funksjoner ukjent. Nylig identifiserte Bjørås’ gruppe to mutasjoner i UCHL1-genet hos pasienter som lider av alvorlige nevrologiske egenskaper, inkludert nevrodegenerasjon med optisk atrofi, spastisitetsparaplegi og ataksi. Ettersom den autofagiske lysosomale banen (ALP) er avhengig av ubiquitin, tror vi at UCHL1-dysfunksjon fører til endringer i ubiquitin-prosessering som derved vil påvirke ALP i hjerneceller. I dette prosjektet ble induserte pluripotente stamceller (iPSC) tidligere reprogrammert fra fibroblaster fra pasienter som huser mutasjonene i UCHL1, så vel som friske individer, brukt som utgangspunkt for å generere monolag av neuroner (FB) og hjerneorganoider. Disse 2D- og 3D-neuronale modellene vil bli brukt til å undersøke effekten av UCHL1-dysfunksjon på nevroutvikling og nevrobeskyttelse via potensielle endringer i ALP. Vi viser at iPSCs og nevrale stamceller (NPC) avledet fra friske individer og pasienter som huser UCHL1-mutasjoner, så vel som hjerneorganoider avledet fra sunne individer ble generert og karakterisert basert på morfologiske funksjoner, og uttrykk for spesifikke markører ved qPCR og ICC. I tillegg viste analyse av autofagisk fluks i NPC ingen dysfunksjon i ALP i pasient- eller sunne kontrollavledede celler, på dette utviklingsstadiet. Foreløpig screening av genekspresjonsnivåer av autofagiske markører i NPC indikerer økt nivå av lysosomalt enzym Cathepsin D i pasientavledet NPC, noe som tyder på potensiell oppregulering av lysosomal funksjon i disse cellene. Disse dataene må imidlertid bekreftes med flere biologiske replikater og på proteinnivå. Vanskeligheter med å dyrke og differensiere NPC, den mellomliggende tilstanden i monolagsprotokollen, hindret ytterligere differensiering til FB-neuroner og utførelse av funksjonelle analyser. Flere forsøk og forskjellige protokoller ble brukt for å overvinne denne begrensningen, men uten å lykkes. Også vanskeligheter med å generere pasient-avledede hjerneorganoider stoppet analysen av potensielle endringer i hjernens utvikling på grunn av UCHL1-mutasjoner. Våre foreløpige data antyder at hvis UCHL1-mutasjoner endrer ALP-funksjonen, kan disse effektene være mer fremtredende på senere utviklingsstadier, for eksempel ved FB eller modne motorneuroner. Til slutt kreves det videre arbeid med utvikling av mer pålitelige og robuste protokoller for generering av NPC, FB-neuroner og hjerneorganoider