AUER, C. G.

SANTOS, A. F. dos

Portuguese

Infoteca-e

182ISSN 1517-5030Colombo, PROutubro, 2007TécnicoComunicadoADCB1 Engenheiro Florestal, Doutor, Pesquisador da Embrapa Florestas. E-mail: auer@cnpf.embrapa.br2 Engenheiro Agrônomo, Doutor, Pesquisador da Embrapa Florestas. E-mail: alvaro@cnpf.embrapa.brDetecção de Fusariumsubglutinans em Sementesde PinusCelso Garcia Auer1Alvaro Figueredo dos Santos2IntroduçãoA preocupação com a entrada de patógenos florestaistem sido a tônica dos programas de sanidade vegetaldos países que têm a atividade florestal como fortecomponente do produto interno bruto (PIB). No Brasil,não poderia ser diferente, considerando que a culturado pínus produziu em 2005 cerca de 9 milhões de m3de madeira serrada, predominantemente na Região Sul,fornecendo matéria-prima para várias finalidades(ANUÁRIO BRASILEIRO DE SILVICULTURA, 2006).Quando se analisam as possibilidades de ingresso depatógenos em uma região ou país, as sementes sedestacam como uma das principais e potenciais vias deingresso (MACHADO, 2002). As sementes podemcarrear os propágulos de patógenos externa einternamente. Quando internamente localizados, osmicrorganismos apresentam-se na forma endofítica enão são facilmente detectáveis. Por esse motivo,torna-se necessária a aplicação de técnicas específicaspara a sua detecção.Desde 2000, existe uma grande demanda por mudas esementes de pínus em decorrência da falta futura demadeira e a retomada dos reflorestamentos. Paraatender essa demanda de sementes, vários lotes têmsido importados. Essa entrada de sementes podefacilitar o ingresso de alguns patógenos exóticos eimportantes para a cultura do pínus. Um dessespatógenos é Fusarium subglutinans, ainda nãoregistrado em espécies de Pinus no Brasil. Váriasespécies de Fusarium foram associadas ao gêneroPinus no Brasil (VENTURA, 1999), principalmente emsementes e em tombamento de mudas (MENDES et al.,1998). Homechin et al. (1986) constataram F.moniliforme, F. oxysporum e F. semitectum em lotesnacionais de sementes de P. elliottii var. elliottii e F.oxysporum em sementes de P. taeda.O presente trabalho descreve um protocolo dedetecção para Fusarium subglutinans em sementes depínus, baseado em trabalhos de Anderson et al. (1984)e Anderson (1986), com ligeiras modificações. O fungoF. subglutinans (Wollenw. & Reinking) P.E. Nelson,2 Detecção de Fusarium subglutinans em Sementes de PinusToussoun & Marasas, conhecido anteriormente comoF. moniliforme var. subglutinans Wollenw. & Reinking,ataca várias espécies de Pinus no exterior, produzindouma doença denominada “Pitch canker” (BLAKESLEEet al., 1980) e que seria traduzida como o cancro dospinheiros sulinos ou cancro resinoso do pínus. Essadoença ataca várias espécies de pínus, destacando-sealgumas que são plantadas no Brasil como P. elliottii,P. taeda, P. oocarpa, e P. maximinoi (CROP..., 2005).A doença causa exsudação de resina no tronco e amortalidade de árvores, pode també atuar como umpatógeno de mudas (BLAKESLEE et al., 1980). O fungoencontra-se distribuído na América do Norte (EUA eMéxico), América do Sul (Chile), Ásia (Japão e Coréia)e África (África do Sul) (CROP..., 2005).Recentemente, esse fungo foi classificado comoFusarium circinatum Nirenberg & O’Donnell (anamorfo)e Gibberella circinata Nirenberg & O’Donnell(teleomorfo) (NIRENBERG; O’DONNELL, 1998).MetodologiaQuando o propágulo está localizado internamente, ouseja, o fungo está presente no tegumento e nos tecidosdo gametófito e do embrião, o patógeno comporta-sede modo endofítico na semente. Ao se proceder ainspeção direta da semente, não existem sinaisexternos visíveis de infecção na sua superfície. Diantedisso, são descritos dois métodos de detecção de F.subglutinans localizados externa ou internamente nassementes de pínus.1) Método do ágarEste método implica no uso de um meio seletivo paraFusarium preparado com 15 g de peptona, 5 g deMgSO4.7H2O, 1 g de KH2PO4, 1 g de PCNB(pentacloronitrobenzeno) e 20 g de ágar em 1.000 mLde água destilada (ANDERSON, 1986). Este meio deveser suplementado com os antibióticos sulfato deestreptomicina (1 g/L) e sulfato de neomicina (1g/L),em ágar fundente antes de ser vertido em placas dePetri.As sementes de pínus não desinfestadas sãoesmagadas com uma pinça ou bastão esterilizados  ecolocadas sobre a superfície do meio seletivo (Figura1A). As placas de Petri são incubadas a 20 °C, sob luzfluorescente, em fotofase de 12 h, por 14 dias. Esteperíodo é suficiente para as colônias fúngicas atingiremcerca de 2 cm em diâmetro e poderem ser examinadas(Figura 1B).Para a identificação do fungo, prepara-se uma lâminacom fragmentos de micélio-ágar e observa-se emmicroscópio ótico. F. subglutinans é caracterizado pelapresença de polifiálides, microconídios emacroconídios.Esse meio seletivo restringe o crescimento da maioriados fungos que não pertençam ao gênero Fusarium.Entretanto, várias espécies de Fusarium e algunsoutros fungos crescerão sobre o substrato. Por estemotivo, a observação das lâminas no microscópio óticoé necessária para a identificação positiva. Se ascolônias apresentarem microconídios em cadeias e emforma de pêra ou clamidósporos, essas não sãoclassificadas como F. subglutinans, mesmo com apresença de polifiálides.2) Método do papel de filtroPara esse método, um caldo nutritivo (15 g depeptona, 5 g de MgSO4.7H2O, 1 g de KH2PO4, 1 g dePCNB (pentacloronitrobenzeno) em 1.000 mL de águadestilada) é vertido sobre uma folha de papel cartão decor azul e esterilizado, em quantidade suficiente parasaturar a folha de papel. A coloração azul do papelfacilita a rápida visualização das colôniasesbranquiçadas de F. subglutinans. Em seguida, o papelcartão umedecido com o caldo nutritivo é colocado emABFigura 1. Visualização do método de detecção de Fusarium sp.em sementes de Pinus taeda em ágar. A. Sementes recém-esmagadas e plaqueadas. B. Presença das colônias deFusarium sp. (seta).3Detecção de Fusarium subglutinans em Sementes de Pinuscaixas de plástico gerbox, previamente desinfestadascom hipoclorito de sódio a 1 %.As sementes de pínus não desinfestadas sãoindividualmente esmagadas sobre uma superfície devidro esterilizado com uma pinça ou bastãoesterilizado. Posteriormente, as sementes sãocolocadas sobre o papel cartão umedecido com o caldonutritivo. As caixas de plástico gerbox são incubadas a20 °C, sob luz fluorescente, em fotofase de 12 h, por14 dias. Este período é suficiente para as colôniasfúngicas atingirem cerca de 2 cm em diâmetro (Figura2).A avaliação deve ser realizada da mesma formautilizada para o método de ágar.Considerações FinaisDe acordo com as regras de análise de sementes(BRASIL, 1992), devem ser analisadas 400 sementespor amostra, a menos que o lote de sementes a seravaliado seja composto de uma quantidade menor.Nesse caso, poderiam ser analisadas um mínimo de100 sementes por amostra.Analisando os dois métodos, verifica-se que o métododo papel de filtro é mais rápido e mais barato do que ométodo em ágar. Outro aspecto a ser ressaltado é que,apesar do uso de antibióticos, o surgimento de colôniasbacterianas pode ocorrer no meio agarizado, impedindoo crescimento das colônias de Fusarium spp. Por outrolado, o método em ágar permite que as culturastenham um período de tempo maior para produzirestruturas fúngicas que ajudem na sua identificação.Para maior eficácia, recomenda-se que os doismétodos sejam usados conjuntamente.Para facilitar a identificação de F. subglutinans, ascolônias são de crescimento lento e têm aspectoesbranquiçado e granular.ReferênciasANDERSON, R. L. A new method for assessing contaminationof slash and loblolly pine seeds by Fusarium moniliforme var.subglutinans. Plant Disease, Saint Paul, v. 70, n. 5, p. 452-453, 1986.ANDERSON, R. L.; BELCHER; E.; MILLER, T. Occurrence ofseed fungi inside slash pine seeds produced in seed orchards inthe United States. Seed Science and Technology, Zurich, n.12, p. 795-799, 1984.ANUÁRIO BRASILEIRO DE SILVICULTURA 2006. Santa Cruzdo Sul: Gazeta Santa Cruz, 2006. 136 p.BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária.Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Coordenação deLaboratório Vegetal. Regras para a análise de sementes.Brasília, DF, 1992. 365 p.BLAKESLEE, G. M.; DWINELL, L. D.; ANDERSON, R. L. Pitchcanker of southern pines: identification and managementconsiderations. Atlanta: USDA, Forest Service, SoutheasternArea, State & Private Forestry, 1980. 15 p. (USDA. For. Serv.Forestry Report SA-FR, 11).CROP protection compendium: datasheet: Gibberella circinata.Disponível em: <http://www.cabicompendium.org/cpc/datasheet.asp?CCODE=GIBBBP&COUNTRY=0>. Acesso em:25 maio 2005.HOMECHIN, M.; PIZZINATTO, M. A.; MENTEN, J. O. M.Sanidade de sementes de Pinus elliottii var. elliottii e Pinustaeda e patogenicidade de Fusarium oxysporum em plântulasde Pinus elliottii var. elliottii. Summa Phytopathologica,Piracicaba, v. 12, n. 1/2, p. 102-112, 1986.MACHADO, J. C. Concept and grouping fungi in relation toseed health testing: an overview. In: MACHADO, J. C.;LANGERAK, C. J.; JACCOUD-FILHO, D. S. (Ed.) Seed-bornefungi: a contribution to routine seed health analysis.Bassersdorf: International Seed Testing Association, 2002. p.9-18.MENDES, M. A. S.; SILVA, V. L. da; DIANESE, J. C.;FERREIRA, M. A. S. V.; SANTOS, C. E. N. dos; GOMESNETO, E.; URBEN, A. F.; CASTRO, C. Fungos em plantas noBrasil. Brasília, DF: EMBRAPA-SPI, EMBRAPA-CENARGEN.1998. 569 p.NIRENBERG, H. I.; O’DONNELL, K. New Fusarium species andcombinations within the Gibberella fujikuroi species complex.Mycologia, New York, v. 90, n. 3, p. 434-458, 1998.VENTURA, J. A. Taxonomia de Fusarium e seus segregados: I- história, meios e procedimentos de cultivo. Revisão Anual dePatologia de Plantas, Passo Fundo, v. 7, p. 271-298, 1999.Figura 2. Detecção de colônias de Fusarium sp. (seta) emsementes de Pinus taeda pelo método do papel de filtro comcaldo nutritivo.4 Detecção de Fusarium subglutinans em Sementes de PinusExemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa FlorestasEndereço: Estrada da Ribeira Km 111, CP 319Fone / Fax: (0**) 41 3675-5600E-mail: sac@cnpf.embrapa.br1a edição1a impressão (2007): conforme demandaPresidente: Luiz Roberto GraçaSecretária-Executiva: Elisabete Marques OaidaMembros: Álvaro Figueredo dos Santos,Edilson Batista de Oliveira, Honorino R. Rodigheri,Ivar Wendling, Maria Augusta Doetzer Rosot,Patrícia Póvoa de Mattos, Sandra Bos Mikich,Sérgio AhrensSupervisão editorial: Luiz Roberto GraçaRevisão de texto: Mauro Marcelo BertéNormalização bibliográfica: Elizabeth Câmara Trevisan,Lidia WoronkoffEditoração eletrônica: Mauro Marcelo BertéComitê dePublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 182CGPE 6523

Detecção de Fusarium subglutinans em sementes de Pinus.

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Detecção de Fusarium subglutinans em sementes de Pinus.

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