Okamura, Lucas Hidenori

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Repositório do INPA

XVI Jornada de Iniciação C,ientífica PIBIC CNPq/FAPEAM/INPA Manaus - 2007Análise de custo da identificação molecular de micobactérias pelatécnica de PCR - Restriction Enzyme Analysis (PRA)Lucas Hidenori OKAMURA1; Julia Ignez SALEM2; Mauricio Morishi OGUSKU3.lBolsista PIBIC INPA/FAPEAM; 2Colaboradora INPA/CPCS; 30rientador INPA/CPCS.o gênero Mycobacterium é constituído por 137 espécies e subespécies oficialmente reconhecidas(DSMZ, 2007). As principais espécies são o M. tubercutosis, o M. africanum (agentes etiológicos daTuberculose, identificados após o isolamento em meio de cultivo) e o M. leprae, apenas visualizadoem amostras clínicas de pacientes com Hanseníase. As demais espécies do gênero são isoladastanto do homem (Salem et aI., 1989a; Salem et aI., 1989b) como do meio ambiente (águas, solos,poeiras e materiais vegetais) e/ou de animais. Estes conhecimentos induziram a proposta de Collinset aI. (1997) em denominar essas micobactérias de "Micobactérias Ambientais" (EnvironmentalMycobacteria - EM). Entretanto, no Brasil, predomina o uso da denominação "Micobactérias nãoTuberculosas" (MNT). Quando a MNT é responsável por doença no homem, esta é denominada deMicobacteriose, independente da espécie micobacteriana (David, 1976). A Micobacteriose por nãoser transmissível, não é de notificação obrigatória perante o Ministério da Saúde, o que faz com quenão se conheça a real incidência dessa patologia no Brasil. Entretanto, acredita-se que tendem aaumentar proporcionalmente ao incremento dos processos e patologias imunossupressoras,associadas ou não a Aids. Para esse grupo de pacientes é fundamental que a espécie micobacterianaseja identificada devido à heterogeneidade de resistência aos medicamentos. Atualmente as MNTpodem ser identificadas por técnicas tradicionais de fenotipagem e/ou por técnicas moleculares. Emum laboratório de referência em micobactérias, para fenotipagem, são realizadas em torno de 25diferentes provas bioquímicas, incluindo seis testes de características de crescimento e produção depigmentos. A execução desses testes requer um tempo médio de 30 dias. Além disso, é necessárioque o laboratório possua grande área física, suporte econômico e equipe técnica de pelo menos oitoprofissionais. Isso torna inviável a identificação fenotípica por laboratórios de pequeno e médio porte(Vega, 2005), tais como o Laboratório de Micobacteriologia do INPA. Na identificação moleculardestaca-se a técnica de PRA (PCR - Restriction Enzyme Analysis) (Silva et aI., 2001). Este métodoconsiste na amplificação de DNA com iniciadores específicos para uma seqüência de 441 pares debases do gene hsp65. Posteriormente, o produto da PCR é clivado com as enzimas de restriçãoBstEII e HaeIII. Após a clivagem, os produtos de restrição são submetidos à eletroforese em gel deagarose a 4% e visualizados em transiluminador de luz ultravioleta (UV). Para a identificação dasmicobactérias, os perfis de restrição obtidos são comparados aos padrões já existentes. Visando apossibilidade de implantação da técnica molecular na rotina do Laboratório de Micobacteriologia doINPA, foi objetivo desse estudo a análise do custo e tempo necessários para a identificação de cepasde MNT pela técnica de PRA. Para análise de custo desta técnica foram solicitadas cotações dosreagentes e materiais plásticos descartáveis e, considerados os de menores custos, porém semdesprezar a qualidade dos mesmos necessários para a realização dos ensaios. No presente estudo,não foi incluído o custo dos equipamentos, pois os mesmos já fazem parte do patrimônio do INPA,sendo desnecessárias novas aquisições. Apesar de não ser objetivo desse estudo foi estabelecidotambém o custo da identificação fenotípica da MNT para comparação em relação à técnica de PRA.Para análise do tempo foi considerado o necessário para a realização de cada etapa: extração deDNA, amplificação de DNA (PCR), eletroforese 1%, digestão dos produtos de PCRe eletroforese 4%.Quarenta e seis cepas micobacterianas foram submetidas à identificação pela técnica de PRAjuntamente com os testes de velocidade de crescimento e produção de pigmento. Foramidentificadas: 12 (26%) cepas de M. tortuitum, 5 (10,8%) M. avium, 4 (8,7%) M. gordonae, 3(6,5%) M. lentiflavum, 2 (4,4%) M. simiae, 2 (4.4%) M. intracellulare, 1 (2,2%) M. farcinogenes, 1(2,2%) M. genavense, 1 (2,2%) M. kansasii, 1 (2,2%) M. phlei, 1 (2,2%) M. szulgai e 1 (2,2%) M.terree (Figura). Em 12 casos (26%), as MNT não puderam ser identificadas, pois apresentaramperfis de restrição diferentes daqueles descritos na literatura. O custo da identificação pela técnicade PRAfoi de R$ 28,76/cepa. Na fenotipagem, para um total de 13 testes bioquímicos necessáriospara a identificação das principais espécies de micobactérias de importância clínica, o custocalculado foi de R$ 106,73/cepa. O custo da técnica de PRA foi semelhante ao relatado porMondragón-Barreto et aI. (2000), R$ 25,48/cepa. Em outro estudo, Prammananan et aI. (2005)definiram o custo em R$ 4,l1/cepa. Porém, nestes estudos não foram mencionados especificamentequais itens (materiais, reagentes ou salário) compuseram o custo da identificação molecular. Emnosso estudo o tempo necessário para a realização da técnica de PRA foi estimado separadamentepara cada etapa: Extração de DNA (2:00h), Protocolo de PCR (3:30min), Eletroforese 1%(1:30min), Protocolo de digestão (4:00h) e Eletroforese 4% (5:00h), totalizando 16 horas detrabalho. Estes resultados indicam o menor custo da técnica de PRAem relação à fenotipagem paraidentificação das espécies de MNT. Vale ressaltar que, independente do custo, um fator importantepara os pacientes suspeitos de Micobacterioses é a abreviação do tempo para conclusão diagnóstica,o que pode ser obtido com a identificação molecular. A técnica de PRA em combinação com os335XVI Jornada de níri;,r;;n Científica PIBIC CNPq/FAPEAM/INPA IVld[JdlJ~ - 2007parâmetros de velocidade de crescimento e produção de pigmento foi suficiente para identificaraproximadamente 75% das MNT analisadas no presente trabalho. Isso evidencia melhor custo-benefício, o que favorece a sua implantação no Laboratório de Micobacteriologia do INPA. A inclusãode mais provas bioquímicas, bem como a realização de estudos adicionais de seqüenciamento deDNA do gene hsp65 ou da região 165 rRNA nas cepas de MNT não identificadas, poderão auxiliar nadefinição de novos padrões de restrição para as MNT ou demonstrar a presença em nossa região deespécies ainda não descritas.Obs.: R$ 1,00 = U5$ 0,51 (Cotação em 21 de junho de 2007).Figura - Eletroforese em gel de agarose 4% do perfil de restriçãode espécies micobacterianas após digestão de fragmentos deDNA (hsp65) com enzimas BstEII e HaeIII. L1 - Ladder 50 paresde bases; L2 - Ladder 25 pares de bases; 1 - M. fortuitum 2; 2 -M. simiae 1; 3 - M. gordonae 5; 4 - PNI*; 5 - M. phlei 1; 6 - M.kansasii; 7 - M. genavense 1; 8 - PNI*.*PNI = Perfil de restrição não identificado.Palavras-chave :Custo; Micobactérias Não Tuberculosas (MNT); PCR-Restriction Enzyme Analysis(PRA); Método diagnóstico.Bibliografias citadasCollins, C. H.; Grange, J. M.; Yates, M. D. 1997. Tuberculosis bacteriology: organization and practice. 2. ed.Oxford: Butterworth-Heinemann. 139p.David, H. L. 1976. Bacteriology of the Mycobacterioses. U.S. Department of Health, Education, and Wellfare(CDC). Atlanta, Georgia, USA. 166p.DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, German Collection of Microorganismsand Cell Cultures. Bacterial Nomenclature up-to-date: approved lists, validation lists. Braunschweig, Germany,2007.Mondragón-Barreto, M.; Vázquez-Chacón, C.A.; Barrón-Rivero, c.; Acosta-Blanco, P.; Jost, K.e.; Balandrano, S.;Oliveira-Díaz, H. Comparision among three methods for mycobacteria identification. Salud Publica Mex,42(6):486-9Prammananan, T.; Cheunoy, W.; Na-Ubol, P.; Tinqtoy, N.; Srimuanq, S.; Chaiprasert, A. Evaluation ofpolymerase chain reaction and restriction enzyme analysis for routine identification of mycobacteria: accuracy,rapidity, and cost analysis. Southeast Asia ] Trop Med Public Health, 36(5):1252-60.Salem, J.I.; Filho P.G.; Lévy-Frébault, V.; Davis, H. 1989a. Isolation and Characterization of MycobacteriaColonizing the Healthy Skin. Acta Leprologica, 7(1):18-30Salem, J.I.; Marója M.F. 1989b. Mycobacteria other than tubercle bacilli in sputum specimens from patients inManaus. Acta Amazonica, 19:349-354Silva, c.r.. Ueki, S.Y.M; Geiger, D.e.P; Leão, S.e. 2001. hsp65 PCR-Restriction Enzyme Analysis (PRA) foridentification of Mycobacteria in the clínical laboratory. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 43(1):25-28.Vega, F.A.F.; Moreno, J.E.; Martin, J.G.; Gutiérrez, J.J.P. 2005. Procedimientos em Microbiologia Clínica -Micobactérias. Sociedad Espafíola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clínica, Espanha. 89p.336

Análise de Custo da Identificação Molecular de Micobactérias Técnica de Pcr - Restriction Enzyme Analysis (pra)

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