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Protein Engineering of the Calb Lipase to Synthesize Fragrance Compounds
Abstract
A computationally-guided semi-rational protein design approach was used to improve
the enzymatic selectivity and catalytic efficiency of Pseudozyma antarctica lipase B
(CalB) to synthesize methyl salicylate and methyl cinnamate. These fatty acid esters
have significant relevance as flavoring and fragrance compounds in the biotechnological
industry. Moreover, CalB is a highly active lipase that is widely used for the enzymatic
hydrolysis and synthesis of esters, offering potential for the biological production of
flavoring agents. However, the relatively confined organization of its active site
precludes the recognition of bulky and aromatic substrates. To overcome this limitation,
in silico docking analyses of CalB were undertaken to identify amino acid residues
involved in precursor binding and recognition. These “hot spots” were subjected to
combinatorial mutagenesis to yield three generations of CalB libraries per substrate. A
surrogate substrate was used to screen for synthetic activity and evaluation of the new
CalB variants revealed mutations giving rise to significant increase in synthetic activity
relative to wild-type CalB. Ultimately, the best CalB variant could serve as a template to
develop an E. coli whole-cell biocatalyst suitable for industrial enzymatic synthesis of
methyl salicylate.</p
Analyse par géomatique des bilans et des flux d'azote et de phosphore dans un bassin versant agricole: le cas de la rivière Boyer.
L'essor et la concentration géographique des productions animales, dans certains bassins versant
à vocation agricole, génèrent d'imposants volumes de fumiers et de lisiers qui dépassent souvent
la superficie de sol disponible pour les valoriser. On assiste alors Ă une surfertilisation des cultures,
qui provoque l'accroissement de la teneur en phosphore du sol, le risque de transfert vers
l'environnement ainsi que le lessivage des nitrates. Ces nutriments, lorsqu'ils dépassent un certain
niveau, sont responsables de l'eutrophisation des cours d'eau. Cette problématique de pollution
diffuse est actuellement largement responsable de la détérioration de la qualité des eaux dans
plusieurs régions du Québec.
Ce projet de maîtrise a pour objectif d'analyser les bilans et les flux d'azote et de phosphore dans
le bassin versant de la rivière Boyer, un bassin où la pollution diffuse a été constatée. Ceci permet
d'estimer les stocks d'éléments nutritifs présents et de définir les zones critiques où les pertes vers
l'environnement sont les plus susceptibles de se produire. Pour ce faire, nous devons considérer
plusieurs données spatiales des différents facteurs qui interviennent, telles que l'occupation du sol,
la topographie, la pédologie, les conditions climatiques, les différentes pratiques culturales, etc.
Ces informations sont intégrées en exploitant les propriétés des Systèmes d'Information
Géographique (SIG) qui tiennent compte de la localisation spatiale des données considérées. Dans
le cadre du présent travail, nous exploitons le SIG IDRISI.
Afin d'obtenir une représentation réaliste du mode de fonctionnement du bassin versant à l'étude,
un bilan des apports et des exportations d'azote et de phosphore et des modèles de pertes
annuelles d'azote et de phosphore sont Ă©tablis au sein du SIG. Les pertes annuelles de phosphore
particulaire et soluble peuvent être estimées en intégrant un modèle de perte de sol au SIG. Les
pertes annuelles d'azote, par lessivage et ruissellement superficiel, sont estimées à l'aide d'un
modèle intégré au SIG, qui est construit à partir de coefficients de pertes tirés de la littérature.
Les charges annuelles de phosphore et d'azote sont cumulées sur l'ensemble du bassin versant.
Le cumul se fait suivant les directions d'écoulement, qui sont déterminées grâce à un algorithme
de drainage interfacé au logiciel IDRISI. Cet algorithme utilise un modèle numérique d'altitude
(MNA) pour générer les directions d'écoulement suivant la plus forte pente. Une comparaison
entre les valeurs des concentrations d'azote et de phosphore, issues des simulations et des valeurs
mesurées en 28 points d'échantillonnage du bassin, permet de discuter des modèles développés
et d'établir des relations avec certaines caractéristiques du territoire
Optimisation de la réaction de Suzuki-Miyaura dans une perspective de synthèse de librairies de peptides
La transcription des symboles et des caractères spéciaux utilisés dans la version originale de ce résumé n’a pas été possible en raison de limitations techniques. La version correcte de ce résumé peut être lue en PDF.
L'utilisation de peptides en tant qu'agents thérapeutiques présente plusieurs avantages. En effet, les peptides sont des molécules qui possèdent une haute affinité et spécificité tout en ayant un profil de toxicité plus bas que la plupart des petites molécules pharmacologiques. De plus, contrairement aux protéines, les peptides sont plus stables aux variations de température et ils possèdent une meilleure pénétration des tissus à cause de leur taille relativement petite. Par contre, leur utilisation est encore limitée. Pour augmenter la spécificité et l'affinité de récepteur, la stabilité sanguine aussi bien que la puissance des peptides, on a fait des modifications chimiques y compris l'introduction de groupements aromatiques, de fonctions hétérocycliques ou de petits fragments de molécule sur la chaîne peptidique. À cet égard, la réaction de Suzuki-Miyaura (SM) s'avère appropriée pour la modification des peptides.
La réaction de SM est le couplage entre un dérivé de l'acide boronique et un halogénure ou un triflate de vinyle ou d'aryle en présence d'un catalyseur de palladium et d'une base. Les principaux avantages de cette réaction sont des conditions de réaction douces, une toxicité moindre pour l'environnement par rapport à la plupart des autres réactifs organométalliques, et la disponibilité commerciale des dérivés de l'acide boronique. Présentement, la réaction de SM est fréquemment utilisée en synthèse organique classique et elle a contribué à accélérer la préparation de composés bioactifs pour des études structure-activité. Toutefois, son usage est toujours très limité pour la conception de dérivés peptidiques et en particulier la réaction n'a jamais été exploitée pour la modification post-synthèse après assemblage d'une chaîne peptidique sur un support solide. Puisque les peptides contiennent des groupements actifs qui pourraient interférer avec la réaction de SM, il nous est apparu plus approprié d'exécuter la réaction en phase solide tandis que tous les groupements des chaînes latérales du peptide sont protégés.
Dans la présente étude, nous montrons une nouvelle stratégie utilisant la réaction de SM
pour modifier en phase solide des peptides contenant un acide aminé aromatique. Le peptide [Ala 1,2,3 , Leu8 ]Enk, lié à une résine de type Wang, a été choisi comme modèle de peptide-résine afin de vérifier la compatibilité avec la méthode de SM.
Notre premier essai, effectué avec le N-a-Fmoc-[Ala 1,2,3 , Phe(pl)4 , Leu ]Enk, lié à une résine Wang, a indiqué que le groupement protecteur Fmoc n'est pas stable dans les conditions basiques utilisées pour la réaction de SM. Le groupement protecteur Fmoc a été ensuite remplacé par un groupe Boe et celui-ci s'est montré compatible avec la
méthode.
Afin d'évaluer les conditions optimales de la réaction de SM nous avons étudié, l'influence de la base, du solvant, du catalyseur, de la température et du temps sur le rendement réactionnel. L'acide phénylboronique a été utilisé pour cette optimisation. Les conditions optimales se sont avérées être le DMF comme solvant, le K3P04 ou le Na2C03
comme base et le Pd(PPh3)4 comme catalyseur, avec un temps de réaction de 20 h et une
température de l'ordre de 80 °C, nous avons poursuivi notre étude afin d'évaluer les rendements avec différents acides boroniques.
En particulier, l'étude a été étendue à l'analyse du comportement de la réaction de SM
lors de substitutions par divers acides boroniques contenant des groupements Ă©lectroÂ
donneurs ou électro-attracteurs. n semble que les dérivés de l'acide phénylboronique
porteurs d'un groupement électro-attracteur sur le cycle aromatique soient plus réactifs
que ceux avec un groupement électro-doneur. Par exemple, 1'acide 4- méthoxyphénylboronique a été complètement inactif dans ces conditions de réaction de SM, tandis que le couplage avec l'acide 4-méthylcarboxyphénylboronique a donné 87%
de conversion. Ces conditions ont également été appliquées en synthèse de dérivés hétéroaromatiques de H2N-[Ala 1,2, 3, Leu8]Enk-OH. À cet égard, les dérivés de l'acide
pyridineboronique, l'acide furaneboronique, et l'acide thiophèneboronique ont été utilisés et ils sont donné de bons rendements. Enfin, la réaction de SM avec des acides alkylboroniques a également été étudiée sur l'iodo-peptide-résine. Les résultats obtenus indiquent que l'acide trans-2-chlorométhylvinylboronique est facilement couplé tandis que l'acide 2-méthylvinylboronique donne seulement 10% de conversion. Des résultats
similaires ont été obtenus pour la modification en phase solide de N-a-Boc-[Ala 1,2,3 ,Leu8]Enk-résine à la position Phe7• Par contre, il semble qu'il y ait un encombrement stérique qui désavantage la réaction de SM lors de modifications à la position Phe7. En
effet, les conversions obtenues à cette position sont plus basses que celles observées lors des modifications effectuées en position Tyr4.
Également, une apprĂ©ciation plus globale de la stratĂ©gie nous est apparue nĂ©cessaire et c'est pourquoi des Ă©tudes additionnelles ont ensuite Ă©tĂ© poursuivies avec des peptides plus complexes, afin de vĂ©rifier la compatibilitĂ© de la mĂ©thode de SM avec des sĂ©quences de peptide contenant des acides aminĂ©s sensibles tels que la mĂ©thionine, la cystĂ©ine, l'histidine et le tryptophane. Pour ce faire, des peptides courts contenant les rĂ©sidus Cys, Met, His ou Trp ont Ă©tĂ© synthĂ©tisĂ©s. La rĂ©action s'est bien dĂ©roulĂ©e avec les peptides contenant Cys, Met ou His. Par contre, la prĂ©sence de Trp semble ĂŞtre problèmatique puisque le mĂ©lange de peptides après la rĂ©action de SM ne contenait pas le peptide attendu. De plus, un peptide possĂ©dant une masse de 34 Da infĂ©rieure Ă celle du produit attendu a Ă©tĂ© froduit. Un rĂ©sultat similaire a Ă©galement Ă©tĂ© obtenu avec le peptide N-aÂ
Boc-[Phe(pl)13]ET-1(9-21). Étant donné que la même réaction secondaire s'est produite en soumettant le peptide N-a-Boc-[BiP13]ET-1(9-21), il peut être conclu que cette perte
de masse s'effectue indépendemment de la présence du résidu Phe(pl). La nature et l'endroit où se produit cette modification reste encore à élucider.
En conclusion le développement de conditions de la réaction de SM appropriées à toutes les séquences peptidiques est un objectif des plus importants afin d'augmenter les outils disponibles pour la modification post-synthèse des peptides.</p
Une nouvelle conception des rapports entre la ville de Montréal et le gouvernement du Québec ? : le contrat de ville de Montréal.
Signé en janvier 2003 par le gouvernement du Québec et la Ville de Montréal, le contrat de ville était présenté comme un outil novateur qui allait modifier les relations entre la
métropole et le gouvernement du Québec. Il s’agit en effet de la première expérience de contractualisation réalisée dans le contexte du système municipal du Québec qui est
marqué par la notion selon laquelle les municipalités sont des créatures des provinces. Nous étions donc intéressé à comprendre les motivations et les raisons qui ont poussé le
gouvernement du Québec à élever au statut de partenaire au sein d’une relation contractuelle la Ville de Montréal et de voir quels ont été les impacts de cette démarche
sur les relations entre le gouvernement et la Ville de Montréal. Étudié sous l’angle du concept d’autonomie locale de Pratchett, de l’analyse politique de la décentralisation de Lemieux ainsi que des écrits théoriques sur la contractualisation – notamment ceux de Gaudin - ce mémoire de maîtrise tente de comprendre dans quelle mesure le contrat de ville a modifié les rapports entre le gouvernement et la Ville de Montréal. La démarche du contrat de ville peut être divisée en deux grandes phases, soit la négociation et la mise en oeuvre du contrat de ville. Nous avons donc analysé le processus de négociation à l’aide des écrits de Lemieux sur la décentralisation et sa typologie des ressources ainsi que du concept de zone d’incertitude de Crozier et Freidberg. Nous avons constaté que lors de cette phase, les signataires du contrat partageaient des motivations compatibles. En effet, le contrat de ville se voulait un outil qui allait contribuer au succès de fusions municipales et soutenir la mise en place de la nouvelle Ville de Montréal. Il s’agissait d’objectifs que poursuivaient le gouvernement et la Ville
de Montréal. Dans ce contexte, le rapport de force entre la Ville et le gouvernement a été « horizontalisé » au sens où les auteurs de la contractualisation l’entendent et la Ville a en a profité pour faire des gains dans le contrat de ville. Le rapport de force a été en quelque sorte renversé lors de la mise en oeuvre du contrat. Une phase marquée par un changement de gouvernement élu en avril 2003 qui ne se sentait, visiblement pas contraint par les engagements pris par le gouvernement précédent dans le cadre du contrat. Cette marche arrière du gouvernement a permis de mettre en lumière un des défauts des mécanismes de contractualisation, soit l’absence de contrainte.
Finalement, l’abandon de certains des engagements inscrits au contrat de ville a eu pour effet de limiter les gains d’autonomie pour la Ville de Montréal qui ont été annoncés lors de la signature de l’entente