Agyi receptor-rendszerek vizsgálata neurológiai kórképekben: speciális és hagyományos autoradiográfiás módszerek alkalmazása Parkinson-kórban, Alzheimer-kórban és az öregedés során = Brain receptor-systems in neurological disorders: special and conventional autoradiographic methods in investigation of Parkinson-disease, Alzheimer-disease and aging

Parkinson kórban a nucleus caudatusban a krónikus l-DOPA kezelésnek betudható csökkent dopamin D2/D3 receptor sűrűség mellett a receptor–G protein jelátvitel kontroll szinten marad, mely funkcionális kompenzáció megnyilvánulása lehet. A gyrus frontalis medialis és gyrus cinguli változatlan dopamin D2/D3 receptor denzitása és szenzitivitása alátámasztja a különböző agyi régiók eltérő mértékű érintettségét és az extrasztriatális tünetek fokozatos megjelenését a Parkinson kór progressziója során. Az új tipusú 125I-SD7015 CB1R ligand nagy érzékenységgel detektálta a CB1R sűrűségbeli különbségeket kontroll és Alzheimer kóros prefrontális minták között. Az Alzheimer kór (AK) korai stádiumaiban tapasztalt szignifikáns CB1R denzitás emelkedés a cannabinoid rendszer neurodegenerációra adott reaktív megnyilvánulása lehet, mely indokolja az AK Braak I-II neuropatológiai stádiumú agyminták kontrolltól különálló csoportba való sorolását. Az Alzheimer kóros prefrontális minták illetve Parkinson kóros putamen és nc caudatus minták esetében, a vizsgált betegségek végső stádiumaiban is ép CB1R populáció alternatív kezelési célpont lehet. Kálium-disztribuciós eljárással egyértelműen elkülöníthető az ischaemiás károsodást szenvedett agyterület az ép régióktól 100 µm vastagságú humán teljes hemispherium metszeteken. A módszer kombinálható a teljes féltekei autoradiográfiával és „térképként” szolgálhat a szomszédos agyterületekkel való összehasonlítás és agyszövet mintavétel során. | Despite the important reduction of dopamine (DA) D2/D3 binding sites in PD nucleus caudate, the increased sensitivity of the remained DA D2/D3 receptors maintains signal transduction effectiveness near to control levels, suggesting functional compensation of DA depletion. In PD middle frontal and cingulated gyrus DA D2/D3 receptor density and sensitivity were on control levels. This supports that dopaminergic neurotransmission of distinct PD brain regions is affected in different extent explaining the gradual appearance of extrastriatal symptoms during PD progression. The novel 125I-SD7015 radioligand (cannabinoid type-1 receptor - CB1R - agonist) detected with high precision CB1R density differences between control and AD prefrontal cortex specimens. In AD Braak I-II sample groups CB1R density was evidently above control levels, suggesting that Braak I-II samples should be studied separately from controls. During the whole progression of AD and PD CB1R densities in prefrontal cortex as well as putamen and nc caudate, respectively, remained on or above control levels showing that CB1R population could serve as alternative target for treatment. Potassium staining method unequivocally differentiated the infarcted brain areas from the intact regions in case of human whole hemisphere sections. This method can be combined with our autoradiographic techniques using whole hemisphere sections; this ’brainmap’ provides base of regional comparison and guide for targeted tissue sampling

Glikogén foszforiláz inhibitorok újszerű metabolikus hatásai

A glikogén anyagcsere szabályozásában fontos glikogén foszforiláz enzimnek nagy szerepe van a máj glükóz termelésének szabályozásában, így a 2-es típusú cukorbetegség kezelésének egyik potenciális célpontja. A KB228 jelű glükóz analóg GF inhibitor in vivo és in vitro vizsgálatát végeztük normál és hiperglikémiás körülmények között. Az in vivo KB228 kezelés hatására növekedett a máj glikogén mennyisége, ami összefüggésben van a máj glükóz felvételének szignifikáns növekedésével. A normál és magas zsírtartalmú diétán tartott egerek glikogén foszforiláz inhibitorral történő kezelése az oxigénfogyasztás emelkedéséhez és a glükóz tolerancia javulásához vezetett. Megjegyzendő, hogy a változás mértéke kisebb volt az elhízott egereknél, ami feltehetőleg azzal magyarázható, hogy a KB228 glükóz motívuma verseng a glükózzal a glikogén foszforiláz enzimhez való kapcsolódásért, így magasabb glükózszint esetén csökken a glikogén foszforiláz inhibitor hatékonysága. HepG2 sejtekkel végzett kísérletek során a KB228 kezelés fokozta a mitokondriális aktivitást és az UCP2 expressziót. Az UCP2 indukciója az egerek májában, sőt harántcsíkolt izomszövetében és C2C12 mioblaszt sejtekben is kimutatható volt, ami a vázizom KB228-indukált fokozott glükóz oxidációban való részvételére utal. További kutatásunk tárgya a metabolikus változások hátterében álló jelátviteli útvonalak feltérképezése volt, melynek során kimutattuk az mTORC2 aktiválódását glikogén foszforiláz gátlás hatására, mely hozzájárulhat a máj glükóz termelésének csökkentéséhez, a glükózfelvétel és a glikogén raktározás fokozásához, ezáltal javítva a cukorbetegség állapotán. Egy másik kísérletsorozatban a glikogén foszforiláz gátlás hatásait vizsgáltuk β sejteken in vivo és in vitro. A KB228 mellett egy szintén glükóz analóg BEVA335 jelű, és egy strukturálisan eltérő CP-31819 GF inhibitort is alkalmaztunk. A glikogén foszforiláz gátlása során a β sejtek modelljeként használt MIN6 sejtekben lévő glikogén mennyisége, valamint a glikogén szemcsék mérete is növekedett. Az inhibitorok alkalmazása aktiválta az IR/PI3K/Akt jelátviteli útvonalat, amit a PI3K specifikus gátlásával is igazoltunk. Emellett észleltük az IRβ glikogén szemcsékkel való kolokalizációját, valamint azonosítottuk az IR jelátviteli útvonal résztvevőit, mint glikogén-kapcsolt fehérjéket. A glikogén foszforiláz inhibitorok fokozták a glükóz-indukált inzulin felszabadulást, valamint növelték a Langerhans szigetek méretét. Eredményeink alapján a glikogén foszforiláz enzim komplex szabályozó folyamatok részét képezi, mely a jövőben felhasználható a cukorbetegség kezelésében.Glycogen phosphorylase, engaged in the regulation of glycogen metabolism, has a major role in hepatic glucose production. Therefore, glycogen phosphorylase has become a validated target to modulate glucose levels in type 2 diabetes mellitus and pharmacological glycogen phosphorylase inhibitors are considered as potential antidiabetic agents. KB228, a glucose analogue glycogen phosphorylase inhibitor, was tested in vitro and in vivo under normal and hyperglycemic conditions on two major glycogen stores, liver and skeletal muscle. KB228 enhanced hepatic glycogen content in vivo that coincided with significantly increased glucose excursion to the liver. KB228 affected the energy balance as well by enhancing oxygen consumption and improving glucose tolerance in mice. However, changes were smaller in high-fat diet-fed mice as compared to the chow-fed animals, probably because high glucose levels, which may reduce the potency of KB228. In vitro studies on HepG2 hepatocytes presented KB228-induced mitochondrial activity, which was paralleled by an increase in UCP2 mRNA and protein levels. The unexpected induction of UCP2 was detected in murine liver and skeletal muscle, as well as C2C12 cells, suggesting the involvement of skeletal muscle in increased glucose oxidation upon KB228 treatment. To further assess metabolic rearrangements triggered by KB228 we investigated certain signaling pathways involved in insulin action and energy homeostasis. We detected induced mTORC2 activity, which modulating hepatic glucose production and glycolysis, as well as inducing glycogen storage and glucose import, may improve diabetes. We also tested whether glycogen phosphorylase inhibition affects β cells in vivo and in vitro using KB228 and another glucose-based glycogen phosphorylase inhibitor BEVA335, and the structurally different CP-316819. Increased glycogen content led to elevated surface of glycogen particles. Glycogen phosphorylase inhibition induced IR/PI3K/Akt signaling cascade. We also showed that IRβ co-localized with glycogen particles, and components of IR signaling were identified as glycogen-bound proteins. Glycogen phosphorylase inhibition also induced glucose-stimulated insulin secretion marked by enhanced glycolysis, mitochondrial oxidation, and calcium signaling. Finally, glycogen phosphorylase inhibitor treatment increased the size of the islets of Langerhans. Taken together these data, we conclude that glycogen phosphorylase might be involved in a complex metabolic regulatory network in the liver, the skeletal muscle and even in the β cells that could be exploited in the management of diabetes

Aktin-szabályozó fehérjék molekuláris organizációja hippokampális idegsejtekben, különös tekintettel az idegi plaszticitás szabályozásában betöltött szerepükre = Organization of actin-regulatory proteins in hippocampal neurons and their relation to synaptic plasticity

A dendrittüskékben magas koncentrációban található szerkezeti fehérje az aktin. Megállapítottuk, hogy a cofilin (amely a filamentumok depolimerizációjáért felelős) a dendrittüskék citoplazmájának membránhoz közeli régiójában található, míg a dendrittüske centrális részén alig fordul elő. Az Arp2/3 komplex (amely a fiamentum elágazódásokért felelős) ugyanakkor a tüskék nem-szinaptikus membránjához közel, de azzal nem asszociálódva egy sávban helyezkedik el és a tüskék geometriai középpontját is elkerüli, de magasabb koncentrációt mutat a tüskék ún. endocitótikus zónájának területén. Továbbá megállapítottuk, hogy az aktin citoszkeleton nem játszik aktív szerepet az endocitótikus zónája helyének kialakításában, ebben elsősorban szinaptikus fehérjék vesznek részt a dynamin nevű fehérjével kölcsönhatásban. Eredmények alátámasztják azt a feltételezést, hogy a dendrittüskék citoszkeletonja rendkívüli módon rendezett. Az aktin szabályozó fehérjék nagyfokú térbeli szegregáltságának köszönhetően az egyes aktin-átalakítási folyamatok egymástól szeparáltan történnek. Ez alapvetően hozzájárul a dendrittüskék aktivitásfüggő plasztikus tulajdonságainak kialakításához. | Actin can be found in high concentration in dendritic spines and serves as the primary cytoskeletal protein. We described, that cofilin (an actin depolimerizator) concentrates within the spinoplasm just beneath the plasma membrane, while it is scarce in the center of the spine. The Arp2/3 complex, which is responsible for the branching of actin filaments, is localized within a torroidal domain, away from the plasma membrane, but also away from the geometrical center of the spine. However, it is also highly concentrated at the endocytic zone. Furthermore we described, that the actin cytoskeleton is not responsible for the definition of the exact location of the endocytic zone, however synaptic proteins (shank, homer) define the location of the EZ with their interaction with dynamin. Our results support that the cytoskeleton of dendritic spines are highly organized. Due to the precise spatial organization of actin-binding proteins, actin remodeling is also likely to be spatially segregated. This actin-cytoskeletal design may play a pivotal role in the precise activity-dependent remodeling of dendritic spines

Funkcionális genomikai, mikro-RNS és fehérjeszintű vizsgálatok a sporadikus mellékvese daganatok patogenezisének tanulmányozására eddig ismeretlen patomechanizmusok felderítése céljából. = Functional genomics, microRNA and protein level studies on sporadic adrenal tumor pathogenesis in search for novel pathomechanisms.

Különböző típusú mellékvese daganatok molekuláris vizsgálatát végeztem mRNS, mikroRNS és fehérje szintű megközelítéssel. A mellékvesekéreg daganatokban a hisztamin bioszintézisért felelős enzim és a hisztamin receptorok eltérő kifejeződését találtuk mind mRNS, mind fehérje szinten: a hisztamin 3-as receptora a malignitás markereként is szóbajön. Mellékvesekéreg daganatokban szignifikáns mikroRNS expressziós különbségeket találtunk a jó- és rosszindulatú mellékvesekéreg daganatok között: legalkalmasabb markernek a miR-503 és miR-511 expressziós különbsége tűnik. A mikroRNS-ek biológiai hatásának felderítésére egy új, párhuzamos mRNS expressziós vizsgálaton alapuló szövetspecifikus target predikciós módszert dolgoztunk ki, ami a sejtciklus G2-M ellenőrzőpontjának károsodását jelezte. Metaanalízis keretében vizsgáltuk a mellékvesekéreg daganatok eddig közölt funkcionális genomikai vizsgálatainak eredményeit, ami három fő patogenetikai útvonalat mutatott ki: 1. a sejtciklus károsodását, 2. a retinsav jelátviteli útvonalat, 3. immun-komplement rendszer eltéréseit. A c-myc protoonkogén csökkent expresszióját, mint központi patogenetikai elemet azonosítottuk. A phaeochromocytomák között is szignifikáns mikroRNS expressziós eltéréseket találtunk különböző sporadikus benignus, öröklődő és sporadikus recidiváló daganatokban. A miR-1225-3p a recidiva markereként jön szóba és bioinformatikai vizsgálat a Notch-jelátvitel fontosságát jelezte a recidiva folyamatában. | Different types of adrenal tumors have been studied by molecular approaches involving mRNA, microRNA and protein level studies. We have observed the differential expression of histamine biosynthetic enzyme and histamine receptors in adrenocortical tumors both at mRNA and protein levels: overexpression of type 3 histamine receptor might be a marker of maignancy. Significant differences in microRNA expression have been found among benign and malignant adrenocortical tumors: difference in the expression of miR-503 and miR-511 seems to be the best marker of malignancy. For the elucidation of the biological relevance of microRNAs, we have developed a novel, tissue-specific target prediction approach based on the results of a parallel mRNA expression profiling: this revealed damage of cell cycle G2-M checkpoint. Results of published functional genomics data on adrenocortical tumors were studied in a meta-analysis that showed three major pathogenic pathways: i. damage of cell cycle, ii. retinoic acid signaling, iii. immune-complement changes. The underexpression of c-myc was revealed as a central pathogenic event in the meta-analysis. Among pheochromocytomas, we have also revealed significant microRNA expression changes in different sporadic benign, hereditary and sporadic recurring tumors. miR-1225-3p was identified as a potential marker of recurrence that could be clinically relevant. Bioinformatical analysis showed the relevance of Notch-signaling in pheochromocytoma recurrence