Identification du cofacteur métallique de la superoxyde dismutase de Corynebacterium glutamicum et clonage des gènes sodA et msrA et étude des régulations de l'expression sous stress oxydatif et radiatif

La SOD cytosolique a été purifiée. Des expériences de substitution de métaux ont montré que la substitution par le manganèse permettait de conserver 84,9 % d'activité spécifique, alors que le cuivre, le fer, le nickel, et le zinc ne permettaient pas de restituer l'activité. L'enzyme est donc une MnSOD stricte (non-cambialistique). Le gène codant, sodA, a été cloné et séquencé. L'analyse du locus chromosomique a permis d'identifier dans l'environnement de sodA, un second gène (msrA, codant un peptide méthionine sulfoxyde réductase), potentiellement impliqué dans la réponse au stress oxydatif. L'analyse de la région promotrice sodA-msrA n'a pas permis de mettre en évidence les sites de fixation des régulateurs éventuels sauf des sites éventuels de fixation de OxyR et IHF. La régulation des deux gènes sodA et msrA a été étudiée par le suivi des variations de l'expression du gène lacZ de E. coli, gène rapporteur placé sous le contrôle des séquences en amont de sodA et de msrA. Des fusions traductionnelles ont été construites, et intégrées dans le génome de C. glutamicum. Diverses conditions environnementales de stress oxydatif, de stress radiatif, de stress thermique, ainsi que l'ajout de métaux in vivo ont été étudiées, mais aucun des stress utilisés n'a permis de révéler une régulation transcriptionnelle de sodA, ni de msrA, sauf pour msrA en phase stationnaire tardive en réponse au choc thermique, ou après irradiation UV. Une étude in silico pour chercher les régulateurs éventuels dans le génome de C. glutamicum a montré l'absence des homologues de soxRS et arcA, la présence de oxyR, et de candidats putatifs homologues de ahpC, ohrR, crp-fnr, IHF, furA, IdeR,DtxR et mntRThe cytosolic SOD was purified. Experiences of metal substitution indicated that the substitution by manganese permitted the conservation of 84,9 % of specific activity, while the use of copper, iron, nickel, zinc did not permit to restore the activity. Thus the enzyme is a strict MnSOD (not-cambialistic). The sodA gene was cloned and sequenced. Analysis of the chromosomal locus allowed the identification of a second gene possibly implicated in oxidative stress response (peptide methionine sulfoxide reductase encoding gene msrA) in the close environment of the sodA gene. The analysis of the promoter region sodA-msrA did not make it possible to highlight the putative sites of fixing of the eventual regulators except possible sites of fixing of OxyR and IHF. Expression of the E. coli lacZ gene, as a reporter gene placed under the control of the upstream sequences of sodA and msrA, was followed as a reflect of sodA and msrA regulation. Integrative transductionnal fusions were transferred into the C. glutamicum genome. Various stresses: oxidative stress, radiative stress, heat shock, in vitro addition of metals was tried, but no regulation was detected for sodA and msrA expression, but in the case of msrA during late stationary phase in response to heat shock, and in response to UV irradiation. An in silico study to seek eventual regulators in the genome of C. glutamicum showed the absence of the homologues of soxRS and arcA, the presence of oxyR, and the presence of putative candidates for ahpC, ohrR, crp-fnr family, IHF, furA, IdeR, DtxR and mntR.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF