固定化脂肪酶在中药活性成分分析中的应用

胰脂肪酶是体内参与脂肪吸收的关键酶，也是治疗以肥胖为代表的代谢性疾病的靶点酶。脂肪酶抑制剂可以通过抑制脂肪酶的活性，达到减肥的目的。同时，固定化酶的制备及应用在近年来受到越来越广泛的关注。固定化酶相比自由酶在稳定性、容易分离、酶活性、生物相容性等方面有明显的优势。本论文探索，利用固定化脂肪酶对中药活性成分进行分析，以实现高效的酶抑制剂筛选、鉴定。 本学位论文由四章组成，前三章为实验部分，分别报道了固定化脂肪酶制备和表征及性质评价、利用固定化脂肪酶对中药材活性成分进行分析以及固定化脂肪酶结合荧光探针筛选、鉴定酶抑制剂；第四章为综述部分，概述了固定化酶合成及其应用的研究进展。 第一章为固定化脂肪酶的制备和表征及性质研究。首先是羧基末端修饰的磁性纳米粒子的制备：用共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子（MNPs），然后利用原硅酸四乙酯对MNPs包裹SiO2并使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷对材料进行氨基修饰；最后用丁二酸酐作为偶联剂，形成酰胺键，使粒子表面带上羧基功能团。其次，用1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为偶联剂，活化羧基化磁性纳米粒子并与脂肪酶交联，形成酰胺键，从而将脂肪酶固定于纳米粒子表面。采用透射电镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、红外光谱（FT-IR）、热重分析（TGA）等手段证实了脂肪酶成功固定于磁性纳米粒子表面；并以酶活性作为参照，比较分析了固定化酶和自由酶的催化活性、热稳定性、重复使用能力、储存稳定性等性质，结果证明脂肪酶经过该法共价固定于磁性纳米粒子后，稳定性、酶活性均明显提高。 第二章为应用固定化脂肪酶对中药材中活性成分进行分析。建立了以酶为药物靶点的有效组分筛选系统，利用活性小分子与酶的特异性结合的特性，以及色谱、质谱的高效分离鉴定能力快速地确认中药组分中的有效成分，实现了有效成分确定、分离的整合。以荷叶提取物为研究目标，用脂肪酶功能化的磁性纳米粒子识别/提取其提取物中的活性成分，结合高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）、多级质谱分析（MSn）技术从中发现并鉴定出2个活性化合物：槲皮素葡萄糖醛酸苷和槲皮素阿拉伯糖半乳糖苷。体外活性验证证实它们具有较强的酶抑制活性；进一步并利用荧光淬灭分析及分子对接手段研究了它们与脂肪酶的亲和特性、作用机制，证实了小分子抑制剂能够通过疏水作用、氢键作用与酶形成静态复合物，有效淬灭脂肪酶荧光。 第三章为利用固定化脂肪酶和荧光探针去筛选、分析中药酶抑制剂。选用胰脂肪酶的荧光底物试卤灵丁酸酯作为荧光探针，固定化脂肪酶水解该底物生成发光产物试卤灵。通过检测反应体系溶液的荧光强度的变化，能够迅速准确判断加入其中的小分子化合物的酶抑制剂活性；对于阳性结果，随即利用磁分离、“配体垂钓”技术，洗脱释放活性小分子。该法的建立可以实现了高通量筛选、鉴定中药活性小分子的目的。利用本方法从黄芩、葡萄籽等中药提取物筛选出了黄芩苷、原花青素A型二聚体等具有抑制脂肪酶活性的天然活性小分子。 最后一章综述了固定化酶合成的载体、合成方法及其应用的研究进展