34 research outputs found

    Investigating Gene Function for Neuronal Survival After Metabolic Stress Using Semi-Automated Fluorescence Microscopy and Automated Image Analysis

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    Overexpression approaches and fluorescence microscopy techniques allow investigating important spatiotemporal aspects of gene regulation as well as quantifying gene function. Consequently, fluorescence microscopy techniques help answer important questions on gene regulation such as addressing the role of a specific gene product for neuronal survival under different treatments. Here, we describe a versatile tool to measure effects of a transfected gene of interest on neuronal survival upon metabolic stress. We focus on nutrient starvation of cultured rodent primary neurons as a model of metabolic stress but our approach can easily be generalized and adapted to other cell types or to investigate single gene function in regulating neuronal survival under various conditions

    Investigating gene function for neuronal survival after metabolic stress using semi-automated fluorescence microscopy and automated image analysis

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    Overexpression approaches and fluorescence microscopy techniques allow investigating important spatiotemporal aspects of gene regulation as well as quantifying gene function. Consequently, fluorescence microscopy techniques help answer important questions on gene regulation such as addressing the role of a specific gene product for neuronal survival under different treatments. Here, we describe a versatile tool to measure effects of a transfected gene of interest on neuronal survival upon metabolic stress. We focus on nutrient starvation of cultured rodent primary neurons as a model of metabolic stress but our approach can easily be generalized and adapted to other cell types or to investigate single gene function in regulating neuronal survival under various conditions

    The evolution of organizational learning in the UN peace operations bureaucracy

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    "This research paper analyzes the efforts of the past decade to turn the UN peace operations apparatus into a learning organization. It begins by examining a traditional organizational culture of peacekeeping, which is the subject of section 2 of this paper. The traditional culture emerged under the conditions of Cold War peacekeeping operations. It prized maximum political flexibility over professional management practices. After the shock of the UN's catastrophic failures in the face of genocide in Rwanda and Srebrenica, this traditional culture came to be challenged by a new generation of peace operations officials. This group of 'reformers' promoted objectives such as critical reflection and organizational learning while the 'traditionalists' sought to protect the organization from excessive bureaucratic standardization. Section 3 details the structural and political constraints to learning that the reform agenda had to deal with in the beginning. The peace operations bureaucracy is a fragile, extremely decentralized and highly politicized organization – and none of these traits have served to promote its capacity to institutionalize learning. Perhaps most importantly, the fact that all but a few civilian staff can only ever receive short-term contracts and have had, in 2009, less than two years of experience in peace operations underscores the adverse career incentives and limited cause to identify strongly with the organization that individuals have. Together with the cultural rift that had begun to emerge in the late 1990s, these structural and political constraints provided the backdrop for the reform efforts that began in 2000 with the so-called Brahimi report, driven by the new generation of managers who gradually came into influential headquarters jobs from the field. Their initial efforts are outlined in section 4, which draws on examples from several in-depth case studies on specific attempts at learning particular lessons in various subject areas of peace operations. After several years of focusing on the nuts and bolts of managing growth, the learning agenda took shape in 2005 as part of 'Peace Operations 2010,' Under-Secretary-General Jean-Marie GuĂ©henno's central professionalization initiative. Section 5 depicts the 'Peace Operations 2010' agenda that put learning at the center of reform efforts, again with illustrations from our in-depth case studies on the impact of those efforts (published in full detail elsewhere). Two of the key elements of Peace Operations 2010 were a top-down guidance development effort and a bottom-up knowledge sharing toolbox, the products of which could be used as a source of feedback to inform the formulation and improvement of guidance for as long as it would take to establish an effective evaluation capacity as well. Training and evaluation, however, did not receive the same level of attention and political/financial support from member states. As a result, even the lessons that were taken up by the organization, debated, refined and formally adopted often languished for lack of effective institutionalization in practice." (author's abstract)"Das Forschungspapier untersucht die BemĂŒhungen der letzten 10 Jahre, den UN-Apparat fĂŒr FriedenseinsĂ€tze in eine 'lernende Organisation' zu verwandeln. Als Ausgangspunkt fĂŒr diesen Prozess analysiert Kapitel 2 die traditionelle Organisationskultur der VN-FriedenseinsĂ€tze. Unter den Bedingungen der Friedenssicherung wĂ€hrend des Kalten Krieges entstand eine Organisationskultur, die ein Maximum politischer FlexibilitĂ€t auch auf Kosten der Professionalisierung von FĂŒhrung und Verwaltung zu sichern suchte. Als eine Folge des katastrophalen Versagens der VN gegenĂŒber dem Völkermord in Ruanda und Srebenica begann eine jĂŒngere Generation von Mitarbeitern, diese traditionelle Kultur herauszufordern. Diese 'Reformer' wollen Ziele wie Selbstkritik und Organisationslernen stĂ€rker verankern, wĂ€hrend die 'Traditionalisten' versuchten, die Organisation vor ĂŒbermĂ€ĂŸiger bĂŒrokratischer Standardisierung zu schĂŒtzen. Kapitel 3 zeigt die strukturellen und politischen Grenzen auf, der die Reforminitiative im Hinblick auf die institutionelle LernfĂ€higkeit der VN-FriedenssicherungsbĂŒrokratie gegenĂŒber stand. Die VN-FriedenssicherungsbĂŒrokratie ist eine fragile, extrem dezentralisierte und höchst politisierte Organisation – und keine dieser Eigenschaften war hilfreich bei der Entwicklung ihrer LernfĂ€higkeit. Die Tatsache dass zivile Mitarbeiter nur auf Kurzzeitbasis angestellt werden und z.B. 2009 im Schnitt weniger als zwei Jahre Erfahrung in FriedenseinsĂ€tzen hatten unterstreicht die problematischen Anreizstrukturen und die mangelnden Grundlagen zur dauerhaften Identifikation des Einzelnen mit der Organisation. Der kulturelle Konflikt seit Ende der 1990er Jahre und diese strukturellen und politischen Hindernisse bildeten den Kontext fĂŒr die Reforminitiative der 2000er Jahre. Diese begann mit dem sog. Brahimi-Bericht 2000 und wurde von hauptsĂ€chlich jĂŒngeren Mitarbeitern vorangetrieben, die aus dem Feld in einflussreiche Positionen im Hauptquartier gelangten. Ihre ersten Schritte werden in Kapitel 4 skizziert, mit Beispielen aus einigen detaillierten Fallstudien ĂŒber konkrete Lernprozesse. FĂŒr die ersten Jahre stand die BewĂ€ltigung des enormen Wachstums der FriedenseinsĂ€tze im Vordergrund. Erst 2005 begann die Lernagenda als Teil von 'Peace Operations 2010', der Professionalisierungsinitiative von UntergeneralsekretĂ€r Jean-Marie GuĂ©henno, Form anzunehmen. Kapitel 5 beschreibt die Initiative 'Peace Operations 2010', die das Thema Lernen in den Mittelpunkt stellte. Dazu dienen wieder Beispiele aus unseren Fallstudien (die in vollem Umfang an anderem Ort veröffentlicht wurden). Zwei der Kernelemente der Initiative waren die EinfĂŒhrung zentralisierter Doktrinentwicklung und dezentralisierten Wissensaustauschs durch eine Reihe von Instrumenten, deren Ergebnisse auch als Feedbackmechanismus fĂŒr Doktrinentwicklung bis zur Entwicklung effektiver Evaluierungsprozesse dienen konnten. Ausbildung und Evaluierung gerieten dabei ins Hintertreffen, sowohl intern als auch von seiten der politischen und finanziellen Aufmerksamkeit der Mitgliedsstaaten. Daher wurden auch die Lehren, die die Organisation aufnahm, diskutierte, verbesserte und letztlich annahm, in der Praxis nicht umgesetzt." (Autorenreferat

    Neuronal Culture Microenvironments Determine Preferences in Bioenergetic Pathway Use

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    In the brain, metabolic supply and demand is directly coupled to neuronal activation. Methods for culturing primary rodent brain cells have come of age and are geared toward sophisticated modeling of human brain physiology and pathology. However, the impact of the culture microenvironment on neuronal function is rarely considered. Therefore, we investigated the role of different neuronal culture supplements for neuronal survival and metabolic activity in a model of metabolic deprivation of neurons using oxygen deprivation, glucose deprivation, as well as live cell metabolic flux analysis. We demonstrate the impact of neuronal culture conditions on metabolic function and neuronal survival under conditions of metabolic stress. In particular, we find that the common neuronal cell culture supplement B27 protects neurons from cell death under hypoxic conditions and inhibits glycolysis. Furthermore, we present data that B27 as well as the alternative neuronal culture supplement N2 restrict neuronal glucose metabolism. On the contrary, we find that the more modern supplement GS21 promotes neuronal energy metabolism. Our data support the notion that careful control of the metabolic environment is an essential component in modeling brain function and the cellular and molecular pathophysiology of brain disease in culture

    Movement disorders after hypoxic brain injury following cardiac arrest in adults

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    Background and purpose: Post-hypoxic movement disorders and chronic post-hypoxic myoclonus are rare complications after cardiac arrest in adults. Our study investigates the clinical spectrum, neuroimaging results, therapy and prognosis of these debilitating post-hypoxic sequelae. Methods: This retrospective study included 72 patients from the neurological intensive care unit at a university hospital, who were diagnosed with hypoxic-ischaemic encephalopathy after cardiac arrest between January 2007 and September 2018. Clinical records were screened for occurrence of post-hypoxic movement disorders and chronic post-hypoxic myoclonus. Affected patients were further analysed for applied neuroprognostic tests, administered therapy and treatment response, and the outcome of these movement disorders and neurological function. Results: Nineteen out of 72 screened patients exhibited post-hypoxic motor symptoms. Basal ganglia injury was the most likely neuroanatomical correlate of movement disorders as indicated by T1 hyperintensities and hypometabolism of this region in magnetic resonance imaging and positron emission tomography computed tomography. Levomepromazine and intrathecal baclofen showed first promising and mostly prompt responses to control these post-hypoxic movement disorders and even hyperkinetic storms. In contrast, chronic post-hypoxic myoclonus best responded to co-application of clonazepam, levetiracetam and primidone. Remission rates of post-hypoxic movement disorders and chronic post-hypoxic myoclonus were 58% and 50%, respectively. Affected patients seemed to present a rather good recovery of cognitive functions in contrast to the often more severe physical deficits. Conclusions: Post-hypoxic movement disorders associated with pronounced basal ganglia dysfunction might be efficiently controlled by levomepromazine or intrathecal baclofen. Their occurrence might be an indicator for a more unfavourable, but often not devastating, neurological outcome

    Systeme fĂŒr Hochleistungsrechnen. Seminar SS 2003

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    Systeme fĂŒr Hochleistungsrechnen sind Parallelrechner, die eingesetzt werden, wenn die Rechenleistung herkömmlicher Einzelprozessorsysteme nicht ausreicht. Die frĂŒher verwendeten, eng gekoppelten Multiprozessorsysteme werden, dem Trend zur globalen Vernetzung folgend, zunehmend durch preiswertere, lose gekoppelte RechnerverbĂŒnde aus Standardrechnerknoten und Massenspeichern ersetzt. Die lose Kopplung ergibt vielfĂ€ltige neue Herausforderungen in der Koordinierung zwischen den Rechnerknoten wie auch innerhalb jedes Knotens, um die Ressourcen im Verbund effizient nutzen zu können. Dies betrifft die koordinierte Zuteilung von Prozessoren und Speicher auf Prozesse ebenso wie die selbstorganisierende Abstimmung der Kommunikation zwischen den Knoten unter BerĂŒcksichtigung der Verbundtopologie. VielfĂ€ltige aktuell diskutierte LösungsansĂ€tze von der Hardwareschicht ĂŒber das Betriebssystem bis zur Anwendungsschicht werden in einer Reihe von BeitrĂ€gen, die im Rahmen des Seminars "Systeme fĂŒr Hochleistungsrechnen" im Sommersemester 2003 erarbeitet wurden, aufgezeigt und erörtert

    Removing critical gaps in chemical test methods by developing new assays for the identification of thyroid hormone system-disrupting chemicals—the athena project

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    The test methods that currently exist for the identification of thyroid hormone system-disrupting chemicals are woefully inadequate. There are currently no internationally validated in vitro assays, and test methods that can capture the consequences of diminished or enhanced thyroid hormone action on the developing brain are missing entirely. These gaps put the public at risk and risk assessors in a difficult position. Decisions about the status of chemicals as thyroid hormone system disruptors currently are based on inadequate toxicity data. The ATHENA project (Assays for the identification of Thyroid Hormone axis-disrupting chemicals: Elaborating Novel Assessment strategies) has been conceived to address these gaps. The project will develop new test methods for the disruption of thyroid hormone transport across biological barriers such as the blood–brain and blood–placenta barriers. It will also devise methods for the disruption of the downstream effects on the brain. ATHENA will deliver a testing strategy based on those elements of the thyroid hormone system that, when disrupted, could have the greatest impact on diminished or enhanced thyroid hormone action and therefore should be targeted through effective testing. To further enhance the impact of the ATHENA test method developments, the project will develop concepts for better international collaboration and development in the area of thyroid hormone system disruptor identification and regulation

    Seronegative myasthenic crisis: a multicenter analysis

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    Myasthenic crisis (MC) is a life-threatening condition for patients with myasthenia gravis (MG). Seronegative patients represent around 10–15% of MG, but data on outcome of seronegative MCs are lacking. We performed a subgroup analysis of patients who presented with MC with either acetylcholine-receptor-antibody-positive MG (AChR-MG) or seronegative MG between 2006 and 2015 in a retrospective German multicenter study. We identified 15 seronegative MG patients with 17 MCs and 142 AChR-MG with 159 MCs. Seronegative MCs were younger (54.3 ± 14.5 vs 66.5 ± 16.3 years; p = 0.0037), had a higher rate of thymus hyperplasia (29.4% vs 3.1%; p = 0.0009), and were more likely to be female (58.8% vs 37.7%; p = 0.12) compared to AChR-MCs. Time between diagnosis of MG and MC was significantly longer in seronegative patients (8.2 ± 7.6 vs 3.1 ± 4.4 years; p < 0.0001). We found no differences in duration of mechanical ventilation (16.2 ± 15.8 vs 16.5 ± 15.9 days; p = 0.94) and length of stay at intensive care unit (17.6 ± 15.2 vs 17.8 ± 15.4 days; p = 0.96), or in-hospital mortality (11.8% vs. 10.1%; p = 0.69). We conclude that MC in seronegative MG affects younger patients after a longer period of disease, but that crisis treatment efficacy and outcome do not differ compared to AChR-MCs

    Hexokinase II-mediated hypoxia tolerance and endogenous neuroprotection

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    Ziel der vorliegenden Arbeit war es nachzuweisen, dass durch die Überexpression der Hexokinase II in primĂ€ren Kortexneuronen ein Zustand Ă€hnlich der endogenen Neuroprotektion und daraus resultierende Hypoxietoleranz induziert wird. ZunĂ€chst wurde hierzu ein Transfektionssystem zur Untersuchung protektiver Gene in primĂ€ren Kortexneuronen etabliert. Basierend auf einem Elektroporationssystem (Nucleofectionℱ) wurde hierbei mit einem Kotransfektions- / Kokultivierungsansatz unter Verwendung grĂŒner und roter Fluoreszenzproteine sowie dem antiapoptosischen Gen BclXL als Positivkontrolle ein neues System zur Analyse potenziell neuroprotektiver Gene in transfizierten primĂ€ren Kortexneuronen etabliert. Die transfizierten Zellen lassen sich bei diesem Ansatz durch die Markierung mit Fluoreszenzproteinen unabhĂ€ngig von der Gesamtzellpopulation, bestehend aus ĂŒberwiegend nicht transfizierten Neuronen, untersuchen. Mit diesem Kotransfektions- / Kokultivierungsansatz wurde der Effekt der Überexpression des glykolytischen Enzyms Hexokinase II auf das Überleben transfizierter primĂ€rer Kortexneurone unter hypoxischen Bedingungen untersucht. Hierbei zeigte sich ein Schutz der Hexokinase II-transfizierten Neurone vor hypoxischem Zelltod. Dieser Hexokinase II-vermittelte Schutz vor neuronalem Zelltod stellte sich als glukoseabhĂ€ngig dar. Die Familie der Hexokinase-Isoenzyme, zu der die Hexokinase II gehört, phosphoryliert Glukose zu Glukose-6-Phosphat. Damit stellen die Hexokinasen SchlĂŒsselenzyme des Glukosemetabolismus dar. Weiterhin gibt es seit einiger Zeit Hinweise auf eine Modulation der Apoptose durch die Hexokinase II. Da hierfĂŒr die mitochondriale Lokalisation der Hexokinase II von großer Bedeutung ist, wurde zum Abschluss der vorliegenden Arbeit mit einem genetischen Screeningverfahren nach neuen Interaktionspartnern der Hexokinase II an der Ă€ußeren Mitochondrienmembran gesucht. Hierbei wurden mit einem modifizierten Yeast-Two Hybrid-Assay erstmals Kandidaten, die an der Hexokinase II vermittelten Zelltodregulation beteiligt sein könnten, als direkte Interaktionspartner der Hexokinase II identifiziert. Die in der vorliegenden Arbeit charakterisierte neuroprotektive Wirkung der Hexokinase II stellt einen Ansatz fĂŒr die Entwicklung neuer Konzepte fĂŒr eine optimierte Schlaganfalltherapie dar. Die Verbindung apoptotischer Regulationsprozesse mit Mechanismen des Glukosemetabolismus hat allerdings auch eine ĂŒber das pathobiologische VerstĂ€ndnis der zerebralen IschĂ€mie hinausgehende Bedeutung. Aufgrund der zentralen Rolle der Hexokinasen im Glukosemetabolismus aller SĂ€ugerzellen ist es möglich, dass die in dieser Arbeit beschriebenen Mechanismen der glukoseabhĂ€ngingen Protektion vor Hypoxie induziertem apoptotischen Zelltod durch Hexokinase II und ihrer hier identifizierten Bindungspartner eine grundsĂ€tzliche biologische Relevanz besitzen. Hierdurch ergeben sich aufgrund des neuen VerstĂ€ndnisses der Hexokinase-abhĂ€ngigen Apoptosemodulation u. A. auch AnsĂ€tze fĂŒr eine Optimierung der Therapie verschiedener maligner Tumore, bei denen eine deutliche Überexpression der Hexokinase II zu beobachten ist.This dissertation demonstrates that Hexokinase II when overexpressed in primary cortical neurons induces a state of hypoxia tolerance which is similar to endogenous neuroprotection. In order to analyse the effects of putative neuroprotective genes, a novel transfection-based approach was established in primary cortical neurons. This approach relies on cotransfection and subsequent cocultivation of neurons with green or red fluorescent proteins and the antiapoptotic gene BclXL. This approach enables the analysis of transfected neurons independent of the total population of cells. This cotransfection / cocultivation approach was used to investigate the effect of overexpressed Hexokinase II on neuronal survival under hypoxic conditions. Hexokinase II mediated a glucose-dependent protection from neuronal cell death under hypoxic conditions. In order to screen for putative interactors of Hexokinase II at the outer mitochondrial membrane, a modified yeast-two hybrid assay was employed. The neuroprotective properties of Hexokinase II open opportunities for the development of novel forms of stroke treatment. Hexokinase II integrates the regulation of apoptosis and glucose metabolism

    Glucose metabolism and cell death regulation in molecular stroke pathophysiology - Mechanisms and new therapeutic targets

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    Das Ziel dieser Arbeit war das VerstĂ€ndnis der molekularen Pathophysiologie des Schlaganfalls, insbesondere bezĂŒglich eines Zusammenhangs von Signalkaskaden des Glukosestoffwechsels und der Zelltodregulation, zu vertiefen und Voraussetzungen fĂŒr eine, auf den untersuchten Mechanismen aufbauende Entwicklung neuer Therapien zu schaffen. Aus den hier diskutierten eigenen Arbeiten ergeben sich sowohl neue AnsĂ€tze fĂŒr die experimentelle Schlaganfallforschung als auch fĂŒr die Entwicklung neuer therapeutischer Targets fĂŒr die Behandlung des Schlaganfalls. Einen konkreten und neuen Ansatz liefert dabei die Inhibition der pro-apoptotischen Oligomerisierung von Bak/Bak durch im Rahmen der eigenen Arbeiten entwickelte small molecule Protein-Protein-Interaktionsinhibitoren. Das Prinzip der Zelltodregulation durch Enzyme des Glukosemetabolismus, wie der in den eigenen Arbeiten untersuchten Hexokinase II, hat dabei eine ĂŒber den Schlaganfall hinausreichende fundamentale biologische Bedeutung. Die aus dieser Arbeit abgeleiteten Mechanismen weisen auf einen grundlegenden biologischen Mechanismus in der Verbindung von Glukosemetabolismus und Zelltodregulation und haben nicht nur eine entscheidende Bedeutung fĂŒr das VerstĂ€ndnis akuter und chronischer neurodegenerativer Erkrankungen, sondern sind darĂŒber hinaus auch von zentraler Relevanz fĂŒr die Regulation des Immunsystems, die Stammzellbiologie und fĂŒr Tumorerkrankungen.The aim of this work was to advance the understanding of the molecular pathophysiology of stroke, in particular with regard to the relationship between the signaling cascades of glucose metabolism and cell death regulation. Furthermore, the aim was to establish the foundation for the development of novel therapies based on these mechanisms. The work discussed here will lead to both novel approaches for experimental stroke research and for the development of new therapeutic targets for the treatment of stroke. A novel and concrete approach is the inhibition of the pro-apoptotic oligomerization of Bak/Bak by small molecule protein-protein interaction inhibitors. The principle of cell death regulation by enzymes of glucose metabolism, such as of Hexokinase II, which has been investigated herein has a fundamental biological significance beyond stroke. The mechanisms identified in this work point to a central biological mechanism in the connection between glucose metabolism and cell death regulation. These mechanisms not only have a crucial significance for the understanding of acute and chronic neurodegenerative diseases, but rather are also of central relevance for the regulation of the immune system, stem cell biology and cancer
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