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    Studien zur zellbiologischen Funktion des „Progressions-assoziierten Proteins“ (PAP) und dessen Bedeutung fĂŒr die InvasivitĂ€t von Mammakarzinomzellen

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    Die Identifizierung von Genen, deren Expression Einfluß auf die Metastasierung von Tumoren nimmt, stellt eine Möglichkeit zur Verbesserung sowohl diagnostischer als auch therapeutischer AnsĂ€tze in der Behandlung von Krebs dar. Jede achte Frau in westlichen Industrienationen erkrankt an Brustkrebs, wobei die Entwicklung neuer Methoden zur frĂŒhzeitigen Erkennung von Metastasen und deren zielgerichtete Behandlung entscheidend ist, um eine Therapie von Patientinnen mit progressivem Mammakarzinom zu ermöglichen. Entwickelt sich eine Zelle eines PrimĂ€rtumors zu einer invasiven metastasierungsfĂ€higen Zelle, so ist fĂŒr diese VerĂ€nderung des PhĂ€notyps eine grundlegende Modifizierung in der Expression zahlreicher Gene zu erwarten. In einem zellulĂ€ren Modellsystem fĂŒr die Progression des Mammakarzinoms wurde in der invasiven Zellinie MCF-7ADR das „Progressions-assoziierte Protein“ (PAP) identifiziert, in der nicht-invasiven Zellinie MCF-7 konnte dagegen keine Expression nachgewiesen werden. Die Aufgabenstellung dieser Arbeit ist die KlĂ€rung der Bedeutung der Expression dieses Gens fĂŒr die VerĂ€nderung einer Zelle von einem nicht invasiven hin zu einem invasiven PhĂ€notyp. PAP stellt ein Protein mit 157 AminosĂ€uren dar und gehört zur PMP22-Genfamilie, deren Mitglieder putative Viertransmembran-Rezeptoren sind. Neben der Hypothese der Einflußnahme von PAP auf die MetastasierungsfĂ€higkeit einer Zelle werden fĂŒr die Homologen eine Vielzahl zellulĂ€rer Funktionen postuliert, wie z.B. die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten, AdhĂ€sionsvermittlung, Zellzyklusregulation, Tumorgenese und Apoptose. Die in dieser Arbeit durchgefĂŒhrten Expressionsstudien zeigten, daß PAP in einer Vielzahl von Normalgeweben exprimiert wird, mit Ausnahme von Geweben des Zentralen Nervensystems (ZNS) und peripherer Blutlymphozyten. Erste vergleichende PrĂ€valenzstudien mittels Northern-Blot- Analysen zwischen Tumor- und Normalgewebe einzelner Patienten wiesen im Fall von Gewebeproben aus Organen des Zentralnervensystems eine positive Korrelation der PAP-Expression mit den Tumorproben auf. Eine Untersuchung von Mammakarzinom-Zellinien mit unterschiedlichem Metastasierungsgrad in der Nacktmaus belegte, daß PAP lediglich in den als metastasierend eingestuften Zellen exprimiert wurde. Über gekoppelte in vitro Transkription/Translation konnte gezeigt werden, daß die in einen Expressionsvektor klonierte PAP-cDNS fĂŒr ein Protein mit einer GrĂ¶ĂŸe von etwa 18 kDa kodierte. Auch mittels Immunfluoreszenzstudien transient transfizierter COS-7-Zellen konnte die Expression eines Epitop-markierten Proteins und die Lokalisierung an der Zellmembran nachgewiesen werden. PAP exprimierende Zellen waren nicht apoptotisch, jedoch oft auffallend abgerundet. Einzelne Klone stabil transfizierter MCF-7-Zellen, die PAP konstitutiv exprimierten, zeigten kein anderes Wachstumsverhalten in Proliferationstests gegenĂŒber der untransfizierten oder den mocktransfizierten MCF-7-Zellen. Auch ihr Verhalten in in-vitro-Invasionstests unterschied sich nicht von dem der Ursprungszellen, wĂ€hrend MCF-7ADR hier starke InvasivitĂ€t aufwies. Eine endgĂŒltige Aussage ĂŒber eine Funktion von PAP bei der Invasion von Tumoren kann jedoch erst nach der Auswertung von Experimenten in NacktmĂ€usen gemacht werden. Durch Serumentzug wachstumsarretierte humane PrimĂ€rzellen zeigten fĂŒr PAP eine inverse Regulation im Vergleich zu dem homologen Protein PMP22. PAP wurde in proliferierenden Zellen stĂ€rker exprimiert als in arretierten, wĂ€hrend fĂŒr PMP22 ein Anstieg der RNS in arretierten Zellen zu beobachteten war. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß alleine die Expression von PAP nicht ausreicht, um MCF-7- Zellen in vitro zur Invasion zu befĂ€higen. DafĂŒr könnten allerdings sowohl extrazellulĂ€re Stimuli, als auch intrazellulĂ€re Interaktionspartner fehlen, die zur Änderung des PhĂ€notyps der Zellen und zur Invasion notwendig sein könnten. Da Rezeptoren jedoch in allen Schritten der Metastasierung von grundlegender Bedeutung sind, kann auch fĂŒr PAP nicht ausgeschlossen werden, daß es in diesen komplexen zellulĂ€ren Mechanismen eine Rolle spielt. Ein Einfluß auf die ProliferationsfĂ€higkeit von Zellen konnte durch die konstitutive Expression von PAP nicht nachgewiesen werden. Eindeutig belegt werden konnte aber eine Korrelation mit dem Zellzyklus. Durch Serumentzug arretierte primĂ€re Zellen zeigten eine verminderte PAP-Expression im Vergleich zu proliferierenden Zellen. Die Überexpression von PAP in COS-7-Zellen lĂ€ĂŸt allerdings die Vermutung zu, daß PAP, ebenso wie das homologe PMP22, einen Einfluß auf die Zellmorphologie und auf die AdhĂ€sion von Zellen haben könnte. PAP könnte dabei in einen AdhĂ€sion-regulierenden Mechanismus eingebunden sein, der bei einer Überexpression von PAP zu einem Abrunden der Zellen und einem Substratkontaktverlust fĂŒhren könnte. Unter physiologischen Bedingungen könnte dies fĂŒr das Loslösen der Zellen wĂ€hrend der G2-Phase des Zellzyklus notwendig sein. Bei einer fehlerhaften Regulation (einer gesteigerten Expression von PAP) unter pathologischen Bedingungen könnte eine leichtere Loslösung von Tumorzellen die Metastasierung begĂŒnstigen. Denkbar wĂ€re eine Interaktion von PAP mit Integrin- Rezeptoren, wodurch die AffinitĂ€t des Integrins beeinflußt werden könnte. Diese Hypothese bietet einen Ansatzpunkt fĂŒr weitere Studien bezĂŒglich des Einflusses von PAP auf zellulĂ€re VorgĂ€nge, wie Zellzyklus-Regulation und Zellwanderung

    Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis

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    We describe a large-scale random approach termed reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) for analyzing and comparing genomic methylation patterns. BglII restriction fragments were size-selected to 500–600 bp, equipped with adapters, treated with bisulfite, PCR amplified, cloned and sequenced. We constructed RRBS libraries from murine ES cells and from ES cells lacking DNA methyltransferases Dnmt3a and 3b and with knocked-down (kd) levels of Dnmt1 (Dnmt[1(kd),3a(−/−),3b(−/−)]). Sequencing of 960 RRBS clones from Dnmt[1(kd),3a(−/−),3b(−/−)] cells generated 343 kb of non-redundant bisulfite sequence covering 66212 cytosines in the genome. All but 38 cytosines had been converted to uracil indicating a conversion rate of >99.9%. Of the remaining cytosines 35 were found in CpG and 3 in CpT dinucleotides. Non-CpG methylation was >250-fold reduced compared with wild-type ES cells, consistent with a role for Dnmt3a and/or Dnmt3b in CpA and CpT methylation. Closer inspection revealed neither a consensus sequence around the methylated sites nor evidence for clustering of residual methylation in the genome. Our findings indicate random loss rather than specific maintenance of methylation in Dnmt[1(kd),3a(−/−),3b(−/−)] cells. Near-complete bisulfite conversion and largely unbiased representation of RRBS libraries suggest that random shotgun bisulfite sequencing can be scaled to a genome-wide approach

    A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo

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    DNA methylation is highly dynamic during mammalian embryogenesis. It is broadly accepted that the paternal genome is actively depleted of 5-methylcytosine at fertilization, followed by passive loss that reaches a minimum at the blastocyst stage. However, this model is based on limited data, and so far no base-resolution maps exist to support and refine it. Here we generate genome-scale DNA methylation maps in mouse gametes and from the zygote through post-implantation. We find that the oocyte already exhibits global hypomethylation, particularly at specific families of long interspersed element 1 and long terminal repeat retroelements, which are disparately methylated between gametes and have lower methylation values in the zygote than in sperm. Surprisingly, the oocyte contributes a unique set of differentially methylated regions (DMRs)—including many CpG island promoters—that are maintained in the early embryo but are lost upon specification and absent from somatic cells. In contrast, sperm-contributed DMRs are largely intergenic and become hypermethylated after the blastocyst stage. Our data provide a genome-scale, base-resolution timeline of DNA methylation in the pre-specified embryo, when this epigenetic modification is most dynamic, before returning to the canonical somatic pattern.Burroughs Wellcome (Career Award)National Institutes of Health (U.S.) (5RC1AA019317)National Institutes of Health (U.S.) (U01ES017155)National Institutes of Health (U.S.) (P01GM099117)National Human Genome Research Institute (U.S.) (1P50HG006193-01

    Strand-specific RNA sequencing reveals extensive regulated long antisense transcripts that are conserved across yeast species

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    Background Recent studies in budding yeast have shown that antisense transcription occurs at many loci. However, the functional role of antisense transcripts has been demonstrated only in a few cases and it has been suggested that most antisense transcripts may result from promiscuous bi-directional transcription in a dense genome. Results Here, we use strand-specific RNA sequencing to study anti-sense transcription in Saccharomyces cerevisiae. We detect 1,103 putative antisense transcripts expressed in mid-log phase growth, ranging from 39 short transcripts covering only the 3' UTR of sense genes to 145 long transcripts covering the entire sense open reading frame. Many of these antisense transcripts overlap sense genes that are repressed in mid-log phase and are important in stationary phase, stress response, or meiosis. We validate the differential regulation of 67 antisense transcripts and their sense targets in relevant conditions, including nutrient limitation and environmental stresses. Moreover, we show that several antisense transcripts and, in some cases, their differential expression have been conserved across five species of yeast spanning 150 million years of evolution. Divergence in the regulation of antisense transcripts to two respiratory genes coincides with the evolution of respiro-fermentation. Conclusions Our work provides support for a global and conserved role for antisense transcription in yeast gene regulation.Canadian Friends of the Hebrew UniversityHoward Hughes Medical InstituteHuman Frontier Science Program (Strasbourg, France)Burroughs Wellcome Fund (Career Award at the Scientific Interface)National Institutes of Health (U.S.). Pioneer AwardBroad Institute of MIT and HarvardU.S.-Israel Binational Science Foundation (BSF)National Human Genome Research Institute (U.S.)Alfred P. Sloan Foundatio

    Targeted next-generation sequencing of a cancer transcriptome enhances detection of sequence variants and novel fusion transcripts

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    Combining next-generation sequencing with capture of sequences from a relevant subset of a transcriptome produces an enhanced view of this subse

    Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

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    The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10

    Features of 80S mammalian ribosome and its subunits

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    It is generally believed that basic features of ribosomal functions are universally valid, but a systematic test still stands out for higher eukaryotic 80S ribosomes. Here we report: (i) differences in tRNA and mRNA binding capabilities of eukaryotic and bacterial ribosomes and their subunits. Eukaryotic 40S subunits bind mRNA exclusively in the presence of cognate tRNA, whereas bacterial 30S do bind mRNA already in the absence of tRNA. 80S ribosomes bind mRNA efficiently in the absence of tRNA. In contrast, bacterial 70S interact with mRNA more productively in the presence rather than in the absence of tRNA. (ii) States of initiation (Pi), pre-translocation (PRE) and post-translocation (POST) of the ribosome were checked and no significant functional differences to the prokaryotic counterpart were observed including the reciprocal linkage between A and E sites. (iii) Eukaryotic ribosomes bind tetracycline with an affinity 15 times lower than that of bacterial ribosomes (Kd 30 ÎŒM and 1–2 ÎŒM, respectively). The drug does not effect enzymatic A-site occupation of 80S ribosomes in contrast to non-enzymatic tRNA binding to the A-site. Both observations explain the relative resistance of eukaryotic ribosomes to this antibiotic
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