8 research outputs found

    Усовершенствование экзонового метода для ускоренного получения кДНК гена реналазы крысы

    Get PDF
    We have improved our previously developed method of exon cloning of cDNA of eukaryotic genes to obtain the rat renalase gene cDNA. In contrast to the previously used step-by-step pairwise assembly of exons, in this work the procedure of full-length cDNA preparation was shortened due to simultaneous assembly of four neighboring exons at once (exons 1-4 and exons 6-9 of the rat renalase gene). The two obtained sequences (exons 1-4 and 6-9) were combined into a full-length cDNA of the rat renalase gene. The cDNA synthesized in this way was cloned into the prokaryotic vector pET-28a(+), which was then expressed in E. coli cells. The correctness of this approach was confirmed by sequencing resultant cDNA sequencing, which showed full (100%) identity with the nucleotide sequence available in the GenBank database (accession code: GenBankNM_001014167).Усовершенствован ранее разработанный нами метод экзонового клонирования кДНК эукариотических генов для получения кДНК гена реналазы крысы. В отличие от ранее использованного постадийного парного объединения экзонов, в данной работе процедура получения полноразмерной кДНК была сокращена за счет того, что мы использовали объединение сразу четырех соседних экзонов (1-4 и 6-9 гена крысы). Две полученные последовательности (экзонов 1-4 и 6-9) объединяли в полноразмерную кДНК гена реналазы крысы. Синтезированную таким образом кДНК клонировали в прокариотический вектор pET-28a(+) с последующей экспрессией в клетках E. coli. Корректность такого подхода подтверждена путем секвенирования полученной кДНК, которая показала полное (100%) совпадение с нуклеотидной последовательностью базы данных (код доступа GenBankNM_001014167)

    Особенности экспрессии и выделения укороченной рекомбинантной реналазы в прокариотических клетках

    Get PDF
    Renalase (RNLS) is a flavoproteinin which its N-terminal peptide (residues 1-17) has several important functions. In cells, it participates in the formation of the so-called Rossmanfold (residues 2-35), needed for «accommodation» of the FAD cofactor and for performing the catalytic functions of RNLS as a FAD-dependent oxidoreductase (EC 1.6.3.5). RNLS secretion into the extracellular space is accompanied by cleavage of this peptide. The resultant truncated extracellular RNLS cannot bind FAD and therefore performs various noncatalytic functions. In this work, we have performed expression the genetic construct encoding RNLS lacking its N-terminal signal peptide (tRNLS) in E. coli Rosetta (DE3) cells. The recombinant protein was accumulated in inclusion bodies in an insoluble form, which could be solubilized in the presence of a high concentration of urea or guanidine chloride. In contrast to full-length RNLS, which was effectively solubilized in the presence of 8 M urea, tRNLS was preferentially solubilized in the presence of 6 M guanidine chloride.Реналаза (RNLS) – флавопротеин, N-концевой пептид которого (1-17 аминокислотных остатка (а.о.)) выполняет несколько важных функций. В клетках он участвует в формировании так газываемой укладки Россмана (2-35 а.о.), необходимой для «размещения» кофактора FAD и выполнения каталитических функций RNLS в качестве FAD-зависимой оксидоредуктазы (КФ 1.6.3.5). При секреции RNLS во внеклеточное пространство этот пептид отщепляется, а образующаяся укороченная внеклеточная RNLS не может связывать FAD и поэтому выполняет различные некаталитические функции. В данной работе мы осуществили экспрессию генетической конструкции, кодирующей лишенную N-концевого сигнального пептида RNLS (tRNLS), в клетках E. coli Rosetta (DE3). Как и в случае полноразмерной RNLS, рекомбинантная tRNLS накапливается в тельцах включения в нерастворимой форме, которая может быть переведена в растворимую форму в присутствии высокой концентрации мочевины или гуанидинхлорида. При этом, в отличие от полноразмерной RNLS, которая солюбилизировалась в присутствии 8 М мочевины, более эффективная солюбилизация tRNLS была достигнута в присутствии 6 М гуанидинхлорида

    Упрощенный метод получения кДНК низкокопийных и молчащих эукариотических генов на примере реналазы человека

    Get PDF
    A simplified «exon» method was developed for producing cDNA of low-copy and silent eukaryotic genes. It is based on assembly of the target gene from genomic DNA by direct synthesis of its exons, followed by their PCR-based joining without further purification of the amplicons. During the synthesis of exons, direct primers were used; these included about ~ 20 nucleotides of the 3`-terminal sequence previous (from the amplified) exon and ~ 20 nucleotides of the 5`-initial sequence of the amplified exon. Reverse primers included ~ 20 nucleotides complementary to the terminal sequence of the amplified exon. Forward and reverse primers flanking the gene to be assembled included the restriction sites necessary for insertion into the expression vector. Using this approach it is possible to assemble almost any eukaryotic gene with a known nucleotide sequence of genomic DNA available in the database.Разработан упрощенный «экзоновый» метод получения кДНК низкокопийных и молчащих эукариотических генов. Он основан на сборе целевого гена с геномной ДНК путем прямого синтеза его экзонов с последующим их объединением ПЦР без дополнительной очистки ампликонов. При синтезе экзонов использовали прямые праймеры, которые включают примерно ~20 нуклеотидов 3’-концевой последовательность предыдущего от амплифицируемого экзона и ~20 нуклеотидов 5’-начальной последовательности амплифицируемого экзона. Обратные праймеры включали ~20 нуклеотидов комплементарной концевой последовательности амплифицируемого экзона. Прямой и обратный праймеры, фланкирующие собираемый ген, включали сайты рестрикции, необходимые для встраивания в экспрессирующий вектор. Такой подход позволяет быстро собрать практически любой эукариотический ген по известной нуклеотидной последовательности геномной ДНК, имеющейся в базе данных

    Исследование чувствительности к протеолизу полноразмерной и укороченной форм рекомбинантной реналазы человека, экспрессированных в прокариотической системе

    Get PDF
    Renalase (RNLS) is a flavoprotein; its N-terminal peptide (amino acid residues 1-17) performs various important functions. Inside cells, it is involved in the Rossmann fold formation (residues 2-35), which is necessary for the binding of the FAD cofactor and the manifestation of the enzymatic activity of RNLS as a FAD-dependent oxidoreductase (EC 1.6.3.5). When RNLS is secreted into the extracellular space, this peptide is cleaved off, and the resulting truncated extracellular RNLS can no longer bind FAD and, therefore, numerous effects described in the literature are carried out by non-catalytic mechanisms. In this work, we have investigated the sensitivity to trypsinolysis of two recombinant forms of human RNLS expressed in prokaryotic cells: (a) full-length RNLS containing the FAD cofactor; (b) a truncated RNLS lacking the 1-17 N-terminal peptide (truncatedRNLS, tRNLS) unable to bind the FAD cofactor. Trypsin (1 unit/20 μL of medium) effectively cleaved both forms of renalase (RNLS and tRNLS). When exposed to a lower concentration of trypsin (0.1 U/20 μL of medium), full length RNLS was more trypsin resistant than tRNLS. We suggest that the different sensitivity of RNLS and tRNLS is apparently determined by the presence of the FAD cofactor in the full-length recombinant protein, which contributes to the formation of a spatial structure that is more resistant to the action of certain proteases.Реналаза (RNLS) – флавопротеин, N-концевой пептид которого (аминокислотные остатки (а.о.) 1-17) выполняет ряд важных функций. В клетках он участвует в формировании укладки Россмана (2-35 а.о.), необходимой для связывания кофактора FAD и проявления ферментативной активности RNLS в качестве FAD-зависимой оксидоредуктазы (КФ 1.6.3.5). При секреции RNLS во внеклеточное пространство этот пептид отщепляется, а образующаяся укороченная внеклеточная RNLS уже не может связывать FAD, и поэтому многочисленные эффекты, описанные в литературе, осуществляются некаталитическими механизмами. В данной работе мы исследовали чувствительность к трипсинолизу двух рекомбинантных форм RNLS человека, экспрессированных в прокариотических клетках: (а) полноразмерной RNLS, содержащей кофактор FAD; (б) укороченной RNLS, лишенной N-концевого пептида 1-17 (truncated RNLS, tRNLS), неспособной связывать кофактор FAD. Трипсин (1 ед./20 мкл среды) эффективно расщеплял обе формы реналазы (RNLS и tRNLS). При воздействии более низкой концентрации трипсина (0.01 ед./20 мкл среды) полноразмерная RNLS была более устойчива к трипсину, чем tRNLS. Мы предполагаем, что различная чувствительность RNLS и tRNLS, по-видимому, определяется присутствием кофактора FAD в полноразмерном рекомбинантном белке, который способствует формированию пространственной структуры, более устойчивой к действию некоторых протеаз

    Конструирование и экспрессия химерного гена реналазы человека, кодирующего N-концевую сигнальную последовательность секреторного белка пролактина

    Get PDF
    Renalase (RNLS) is a protein that performs various protective functions both inside and outside cells. Intracellular RNLS is a FAD-dependent oxidoreductase (EC 1.6.3.5). Extracellular RNLS lacking an N-terminal peptide does not interact with FAD and exhibits various protective effects on the cell through interaction with receptor proteins. The mechanisms and factors responsible for RNLS transport out of the cell are not fully understood. It is well known that the signal sequence plays a key role in the classical mechanism of protein transport outside cells. One of the approaches to study the secretion of RNLS from the cell can be the creation of chimeric forms of the protein with a modified N-terminal amino acid signal sequence. Bioinformatics analysis showed that the signal sequence of the prolactin gene (PRL), connected to the template sequence of the RNLS gene, gave the classic signal characteristic of secretory proteins. On this basis, this paper describes: (i) a method for constructing the human RNLS gene in which the N-terminal sequence encoded by the RNLS gene was replaced by the N-terminal sequence encoded by the PRL gene; (ii) expression of this chimeric genetic construct.Реналаза (RNLS) - белок, который выполняет различные защитные функции как внутри, так и снаружи клеток. Внутриклеточная RNLS проявляет свойства FAD-зависимой оксидоредуктазы (КФ 1.6.3.5). Внеклеточная RNLS, лишенная N-концевого пептида, не взаимодействует с FAD, проявляет различные защитные эффекты на клетку посредством взаимодействия на рецепторные белки. Механизмы и факторы, ответственные за транспорт RNLS из клетки, до конца не изучены. Хорошо известно, что сигнальная последовательность играет ключевую роль в классическом механизме транспорта внутриклеточных белков. Одним из подходов для изучения секреции RNLS из клетки может быть создание химерных форм белка с модифицированной N-концевой сигнальной аминокислотной последовательности. Биоинформатический анализ показал, что сигнальная последовательность гена пролактина (PRL), соединенная с матричной последовательностью гена RNLS, давала классический сигнал, свойственный секреторным белкам. Исходя из этого, в данной работе: (i) описан метод конструирования гена RNLS человека, в котором N-концевая последовательность, кодируемая геном RNLS, была заменена на N-концевую последовательность, кодируемую геном PRL; (ii) проведена экспрессия этой химерной генетической конструкции

    Конструирование химерного гена реналазы человека с модифицированным N-концом

    Get PDF
    Renalase (RNLS) is a recently discovered protein that plays different roles inside and outside cells. Extracellular RNLS exhibits protective effects on the cell, acting on its receptor proteins, while intracellular RNLS acts as FAD-dependent oxidoreductase (EC 1.6.3.5). The ratio of the intracellular and extracellular forms of this protein, as well as the mechanisms and factors responsible for its transport from the cell, remain unknown. One of the approaches to studying these issues can be the creation of chimeric forms of this protein with modified fragments of its amino acid sequences. This work describes a method for constructing a chimeric human RNLS gene encoding RNLS without its N-terminal peptidРеналаза (RNLS) - недавно открытый белок, который выполняет различные функции внутри и снаружи клеток. Внеклеточная RNLS оказывает защитные эффекты на клетку, действуя, по данным ряда авторов, на свои рецепторные белки, внутриклеточная RNLS проявляет свойства FAD-зависимой оксидоредуктазы (КФ 1.6.3.5). Соотношение внутриклеточных и внеклеточных форм этого белка, а также механизмы и факторы, ответственные за его транспорт из клетки остаются неизвестными. Одним из подходов для изучения этих вопросов может быть создание химерных форм белка с модифицированными фрагментами его аминокислотных последовательностей. В данной работе описан метод конструирования химерного гена RNLS человека, кодирующего RNLS без N-концевого пептида

    1.2.3.27 References for 1.2.2 and 1.2.3

    No full text
    corecore