Mefloquine-based chiral selectors and stationary phases (MFQ-CSPs)

Die Trennung von Racematen in ihre Enantiomere mittels chiralen stationären Phasen nahm sowohl in der Analytischen Chemie als auch in der Industrie in den letzten Jahrzehnten an Bedeutung zu. Nicht zuletzt wegen der Notwendigkeit enantiomerenreine Medikamente, die die gewünschte Wirkung erzielen, zu produzieren. Die Synthese von neuen Selektoren basierend auf Mefloquin als auch die Evaluierung von chiralen stationären Phasen immobilisiert mit Mefloquinderivaten, waren Ziele der vorliegenden Diplomarbeit. Die Anionenaustauscher stationären Phasen basierend auf Chinchona Alkoloiden (Chinin und Chinidin), entwickelt in unserer Arbeitsgruppe, waren Motivation für die Entwicklung von auf Mefloquin beruhenden stationären Phasen. Mefloquin sollte aufgrund der vermuteten π-sauren Natur der Chinolin-Einheit für die Enantiomerentrennung von π-basischen Analyten geeignet sein. Wir synthetisierten verschiedene enantiomerenreine N-allyl Mefloquinderivate. Ausgewählte Derivate wurden als Selektoren auf modifiziertem Kieselgel immobilisiert, um neue chirale stationäre Phasen zu erhalten. Die strukturelle Ähnlichkeit von Mefloquin und den Chinchona Alkaloiden ermöglichte, durch Vergleich der Elutionsreihenfolge der entsprechenden Weinsäureester, die Bestimmung der Elutionsreihenfolge von den erythro Enantiomeren des N-allyl Mefloquins. Zusätzlich konnte die Absolutkonfiguration des (9S,10R)-N-allyl Mefloquins mittels Röntgenstrukturanalyse bestimmt werden, womit unser chromatographischer Ansatz bestätigt wurde. Für die Evaluierung der neuen stationären Phasen wurden π-basische als auch polyfluorierte Analyte synthetisiert. Des Weiteren wurden diese Selektanden auch für NMR Studien mit ausgewählten Selektoren verwendet. Die NMR Studien ergaben, dass Mefloquinderivate und Chinidin in vergleichbarer Weise mit Selektanden interagieren. Es konnten allerdings keine zusätzlichen Fluor-Wechselwirkungen zwischen Mefloquin und polyfluorierten Analyten beobachtet werden. Eine effiziente Trennung der Mefloquinderivate wurde mittels eines Kationenaustauschers als chirale stationäre Phase erreicht. Aufgrund dessen, entwickelten wir neue Kationenaustauscher-Säulen basierend auf Syringasäure. Die Evaluierung der neuen Kationenaustauscher-Säulen ergab eine bessere Enantiomerentrennung für Mefloquinderivate im Vergleich zu einer in unserer Arbeitsgruppe etablierten Kationenaustauscher-Säule. Des Weiteren ergab die Evaluierung der neuen Kationenaustauscher-Säulen, dass ein Selektor basierend auf Mefloquin effizienter in seine Enantiomere getrennt werden kann, wenn der Stickstoff des Piperidins als sekundäres Amin, wie eben im Mefloquin, vorliegt.In the last decades chromatographic enantioseparation with chiral stationary phases (CSPs) has become a widely used analytical and industrial tool, mainly because of the importance of enantioseparation in the drug development. The aim of the presented thesis was to synthesize novel selectors based on mefloquine and to evaluate their potential as a new anion exchange type of chiral stationary phases. In the design of the novel selector we were inspired by a commercially available QN-AX and QD-AX CSP respectively, which were developed in our working group. We assumed that a π-acidic quinoline unit of mefloquine (in contrast to a π-basic core of quinine) would lead to an altered separation of π-basic analytes. We synthesized several different enantiomerically pure selectors based on N-allyl mefloquine and immobilized some of them on mercaptopropyl modified silica gel. The structural resemblance of mefloquine to chinchona alkaloids (quinine, quinidine) allowed us to determine the elution order of N-allyl mefloquine enantiomers. The absolute configuration of (9R,10S)-N-allyl mefloquine was verified by the x-ray analysis. In order to evaluate the prepared CSPs based on mefloquine, several new π-basic and fluorophilic leucine derivatives were prepared. These selectands (SAs) were further used for NMR studies with selected selectors. Corresponding to the NMR studies, we found out that the mefloquine selectors interact with selected leucine analytes in a similar way as the chinchona based selectors. We have not found any additional fluorophilic interactions for N-allyl mefloquine with polyfluorinated analytes, which could be considered as a drawback of the new selectors. We found that N-allyl mefloquine derivatives and mefloquine itself can be effectively separated on strong cation exchanger columns. Therefore we developed a novel strong cation exchanger based on O-allyl syringic acid with trans-2-aminocyclohexanesulfonic acid. We proved that the separation of several types of mefloquine-based compounds was better with our new SCX CSPs. Furthermore, we discovered during the evaluation of the novel SCX CSPs that a selector based on mefloquine with non-derivatized nitrogen in the piperidine moiety will be more efficiently enantioseperated, which was also non expected. To conclude, we designed and synthesized several novel chiral selectors based on mefloquine and evaluated the applicability in enantioseparation using NMR and HPLC methods. In addition we developed novel SCX chiral stationary phases, which can be used for enantioseparation of mefloquine derivatives and chiral amines in general

Quality control requirements for the correct annotation of lipidomics data.

10.1038/s41467-021-24984-yNature Communications121477

Vysokoúčinná superkritická fluidní chromatografie – hmotnostní spektrometrie pro kvalitativní analýzu metabolitů pokrývající velký rozsah polarity

The applicability of ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography coupled with mass spectrometry (UHPSFC/MS) for the qualitative analysis of metabolites with a wide polarity range (log P: -3.89-18.95) was evaluated using a representative set of 78 standards belonging to nucleosides, biogenic amines, carbohydrates, amino acids, and lipids. The effects of the gradient shape and the percentage of water (1, 2, and 5%) were investigated on the Viridis BEH column. The screening of eight stationary phases was performed for columns with different interaction sites, such as hydrogen bonding, hydrophobic, pi-pi, or anionic exchange type interactions. The highest number of compounds (67) of the set studied was detected on the Torus Diol column, which provided a resolution parameter of 39. The DEA column had the second best performance with 58 detected standards and the resolution parameter of 54. The overall performance of other parameters, such as selectivity, peak height, peak area, retention time stability, asymmetry factor, and mass accuracy, led to the selection of the Diol column for the final method. The comparison of additives showed that ammonium acetate gave a superior sensitivity over ammonium formate. Moreover, the influence of the ion source on the ionization efficiency was studied by employing atmospheric pressure chemical ionization (APCI) and electrospray ionization (ESI). The results proved the complementarity of both ionization techniques, but also the superior ionization capacity of the ESI source in the negative ion mode, for which 53% of the analytes were detected compared to only 7% for the APCI source. Finally, optimized analytical conditions were applied to the analysis of a pooled human plasma sample. 44 compounds from the preselected set were detected in human plasma using ESI-UHPSFC/MS in MS E mode considering both ionization modes. (C) 2022 Published by Elsevier B.V.Použitelnost vysokoúčinné superkritické kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií (UHPSFC/MS) pro kvalitativní analýzu metabolitů s širokým rozsahem polarity (log P: -3,89-18,95) byla hodnocena pomocí reprezentativní sady 78 standardů patřících k nukleosidům, biogenním aminům, sacharidům, aminokyselinám a lipidům. Účinky sklonu gradientu a procentuálního podílu vody (1, 2 a 5 %) byly zkoumány na koloně Viridis BEH. Prověrka osmi stacionárních fází byla provedena pro kolony s různými místy interakce, jako jsou interakce typu vodíkové vazby, hydrofobní, pí-pí nebo aniontová výměna. Nejvyšší počet sloučenin (67) studované sady byl detekován na koloně Torus Diol, která poskytla parametr rozlišení 39. Sloupec DEA měl druhý nejlepší výkon s 58 zjištěnými standardy a parametrem rozlišení 54. Celkový výkon dalších parametrů, jako je selektivita, výška píku, plocha píku, stabilita retenčního času, faktor asymetrie a přesnost hmotnosti, vedl k volbě Diol kolony pro finální metodu. Srovnání přídatných látek ukázalo, že octan amonný dává vyšší citlivost než mravenčan amonný. Vliv iontového zdroje na účinnost ionizace byl navíc zkoumán využitím chemické ionizace atmosférického tlaku (APCI) a elektrosprejové ionizace (ESI). Výsledky prokázaly komplementaritu obou ionizačních technik, ale také vyšší ionizační kapacitu zdroje ESI v režimu záporných iontů, pro který bylo detekováno 53% analytů oproti pouhým 7% u zdroje APCI. Nakonec byly na analýzu směsného vzorku lidské plazmy aplikovány optimalizované analytické podmínky. 44 sloučenin z předem vybrané sady bylo detekováno v lidské plazmě pomocí ESI-UHPSFC/MS v režimu MS(E) s ohledem na oba ionizační režimy

Lipidomic Analysis Using Ultrahigh-Performance Supercritical Fluid Chromatography-Mass Spectrometry

Vysokoúčinná superkritická fluidní chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií s elektrosprejovou ionizací (UPHSFC/ESI-MS) je technika vhodná pro nepolární i polární látky, což je v lipidomické analýze velkou výhodou. Lipidy v krevní plasmě byly separovány do lipidových tříd pomoci kolony Acquity BEH UPC2 (100 mm × 3 mm, 1,7 µm) a gradientové eluce se složením mobilní fáze CO2 a směsi methanol – voda (99:1 v/v) obsahující 30 mM octan amonný. Během 6 minutové analýzy došlo k rozdělení lipidů do 9 tříd. Následná kvantifikace by měla sloužit ke srovnání lipidů v plazmě zdravých a nemocných jedinců.Ultrahigh-Performance Supercritical Fluid Chromatography with electrospray ionization mass spectrometry (UPHSFC/ESI-MS) is suitable for non-polar and polar substances, which is a great advantage in lipidomic analysis. Lipids in plasma were separated into lipid classes using an Acquity BEH UPC2 column (100 mm x 3 mm, 1,7 μm) and a gradient elution of the mobile phase of CO2 and methanol-water mixture (99:1 v/v) containing 30 mM ammonium acetate. During the 6 minute analysis lipids were divided into 9 lipid classes. Subsequent quantification should serve to compare lipids in the plasma of healthy and diseased individuals

Silné stacionární fáze se smíšeným režimem pro kationtovou a zwitteriontovou výměnu pro separaci léčiv a biogenních aminů v různých chromatografických režimech

A set of new mixed-mode ion-exchange stationary phases is presented. The backbone of organic selectors is formed by a linear hydrocarbon chain, which is divided into two parts of various lengths by a heteroatom (oxygen or nitrogen). In all studied cases, there is a sulfonic acid moiety as the terminal group. Therefore, selectors bearing oxygen gave rise to strong cation ion-exchange stationary phases, while selectors with an embedded nitrogen atom (inducing a weak anion exchange capacity) were used to create zwitterion ion-exchange stationary phases. The new mixed-mode stationary phases were chromatographically evaluated in high performance liquid chromatography (HPLC) and supercritical fluid chromatography (SFC) using isocratic elution conditions to disclose their chromatographic potential. In HPLC mode, aqueous-rich reversed phase chromatography, acetonitrile-rich hydrophilic interaction liquid chromatography and methanolic ion-exchange chromatography mobile phases were employed. In these chromatographic modes, retention factors and selectivity values for a test set of basic and zwitterionic analytes were determined. The results were compared and principal component analysis for each chromatographic mode was performed. For all chromatographic modes, the component 1 in the principal component analysis reflected the elution order. The application of different mobile phases on a particular column resulted not only in variation in retention, but also in modified selectivity, and different elution order of the analytes. The orthogonality of the elution order depending on the employed mobile phase conditions was especially reflected for structurally closely related analytes, such as melatonin and N-acetyl-serotonin, tryptamine and serotonin or noradrenalin and octopamine. However, ion-exchange interactions remain the main driving force for retention. From all investigated stationary phases, the SCX 2 (C5-linker and C4-spacer) seems to be the best choice for the separation of basic analytes using different mobile phase conditions. (C) 2020 Elsevier B.V. All rights reserved.Je představena sada nových smíšených režimů stacionárních fází ionexové výměny. Páteř organických selektorů je tvořena lineárním uhlovodíkovým řetězcem, který je rozdělen na dvě části různých délek heteroatomem (kyslík nebo dusík). Ve všech studovaných případech je jako koncová skupina skupina kyseliny sulfonové. Proto selektory nesoucí kyslík vedly ke vzniku silných kationtových iontoměničových stacionárních fází, zatímco selektory se zabudovaným atomem dusíku (indukující slabou kapacitu aniontové výměny) byly použity k vytvoření stacionárních fází iontovýměnného zwitteriontu. Nové stacionární fáze se smíšeným režimem byly chromatograficky hodnoceny pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) a superkritické kapalinové chromatografie (SFC) za použití izokratických elučních podmínek k odhalení jejich chromatografického potenciálu. V režimu HPLC byla použita mobilní chromatografie s obrácenými fázemi bohatá na vodu, kapalná chromatografie s hydrofilní interakcí bohatou na acetonitril a mobilní fáze s iontoměničovou chromatografií. V těchto chromatografických režimech byly stanoveny retenční faktory a hodnoty selektivity pro testovací sadu základních a zwitteriontových analytů. Výsledky byly porovnány a byla provedena analýza hlavních složek pro každý chromatografický režim. U všech chromatografických režimů odrážela složka 1 v analýze hlavní složky eluční pořadí. Aplikace různých mobilních fází na konkrétní koloně vedla nejen k odchylkám v retenci, ale také k modifikované selektivitě a odlišnému pořadí eluce analytů. Ortogonalita elučního řádu v závislosti na podmínkách použité mobilní fáze se projevila zejména u strukturně úzce souvisejících analytů, jako je melatonin a N-acetyl-serotonin, tryptamin a serotonin nebo noradrenalin a oktopamin. Interakce iontové výměny však zůstávají hlavní hnací silou retence. Ze všech zkoumaných stacionárních fází se SCX 2 (C5-linker a C4-spacer) jeví jako nejlepší volba pro separaci základních analytů za různých podmínek mobilní fáze

Ultravysoko-účinná superkritická fluidní chromatografie / hmotnostní spektrometrie v lipidomické analýze

Ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography/mass spectrometry (UHPSFC/MS) is one of the fastest analytical approaches for high-throughput lipidomic analysis covering a wide range of lipid categories and classes. Lipid class separation and lipid species separation are two main separation modes available for the UHPSFC analysis of lipids. The mechanism of the lipid class separation mode is com-parable to that of hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC). The direct comparison of HILIC -ultrahigh-performance liquid chromatography (HILIC-UHPLC) and UHPSFC shows the applicability of UHPSFC/MS for high-throughput quantitation of both nonpolar and polar lipid classes, the faster analysis time, and comparable reproducibility and sensitivity. The retention mechanism of the lipid species separation mode is comparable to reversed-phase UHPLC, but the nonpolar character of supercritical carbon dioxide (scCO(2)) provides a different selectivity compared to that of conventional RP-UHPLC. The introduction of various hyphenation interfaces to MS broadens the applicability and sensitivity range of UHPSFC/MS using scCO(2) as the main component of the mobile phase. The addition of ionic additives (volatile salts, acids, and bases) to the modifier improves the separation of medium to polar lipids. Furthermore, UHPSFC/MS has also a great potential in the chiral separation of lipids, but the field has not yet been fully explored.Ultravysoko-účinná superkritická fluidní chromatografie / hmotnostní spektrometrie (UHPSFC/MS) je jedním z nejrychlejších analytických přístupů pro vysoce výkonnou lipidomickou analýzu pokrývající širokou škálu kategorií a tříd lipidů. Separace tříd lipidů a separace lipidových druhů jsou dva hlavní separační režimy dostupné pro analýzu lipidů UHPSFC. Mechanismus režimu separace lipidů je srovnatelný s mechanismem hydrofilní interakce kapalinová chromatografie (HILIC). Přímé srovnání HILIC-UHPLC a UHPSFC ukazuje použitelnost UHPSFC/MS pro vysoce výkonnou kvantifikaci nepolárních i polárních lipidových tříd, rychlejší dobu analýzy a srovnatelnou reprodukovatelnost a citlivost. Retenční mechanismus režimu separace lipidových druhů je srovnatelný s reverzní fází UHPLC, ale nepolární charakter superkritického oxidu uhličitého (scCO(2)) poskytuje odlišnou selektivitu ve srovnání s konvenčním RP-UHPLC. Zavedení různých rozhraní dělení do MS rozšiřuje použitelnost a rozsah citlivosti UHPSFC/MS s využitím scCO(2) jako hlavní složky mobilní fáze. Přidáním iontových aditiv (těkavých solí, kyselin a zásad) do modifikátoru se zlepšuje separace středních a polárních lipidů. Dále má UHPSFC/MS také velký potenciál v chirální separaci lipidů

Validace lipidomické analýzy lidské plazmy a séra pomocí superkritické fluidní chromatografie - hmotnostní spektrometrie a kapalinová chromatografie s hydrofilní interakcí - hmotnostní spektrometrie

Ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography-mass spectrometry (UHPSFC/MS) has a great potential for the high-throughput lipidomic quantitation of biological samples; therefore, the full optimization and method validation of UHPSFC/MS is compared here with ultrahigh-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC/MS) in hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) mode as the second powerful technique for the lipid class separation. First, the performance of six common extraction protocols is investigated, where the Folch procedure yields the best results with regard to recovery rate, matrix effect, and precision. Then, the full optimization and analytical validation for eight lipid classes using UHPSFC/MS and HILIC-UHPLC/MS methods are performed for the same sample set and applied for the lipidomic characterization of pooled samples of human plasma, human serum, and NIST SRM 1950 human plasma. The choice of appropriate internal standards (IS) for individual lipid classes has a key importance for reliable quantitative workflows illustrated by the selectivity while validation and the calculation of the quantitation error using multiple internal standards per lipid class. Validation results confirm the applicability of both methods, but UHPSFC/MS provides some distinct advantages, such as the successful separation of both non-polar and polar lipid classes unlike to HILIC-UHPLC/MS, shorter total run times (8 vs. 10.5 min), and slightly higher robustness. Various types of correlations between methods (UHPSFC/MS and HILIC-UHPLC/MS), biological material (plasma and serum), IS (laboratory and commercially mixtures), and literature data on the standard reference material show the intra- and inter-laboratory comparison in the quantitation of lipid species from eight lipid classes, the concentration differences in serum and plasma as well as the applicability of non-commercially available internal standard mixtures for lipid quantitation.Vysokoúčinná superkritická fluidní chromatografie-hmotnostní spektrometrie (UHPSFC / MS) má velký potenciál pro vysokoúčinnou lipidomickou kvantifikaci biologických vzorků; proto je zde úplná optimalizace a validace metody UHPSFC / MS srovnávána s ultravysokoúčinnou kapalinovou chromatografií-hmotnostní spektrometrií (UHPLC / MS) v režimu hydrofilní interakční kapalinové chromatografie (HILIC) jako druhé výkonné techniky pro separaci lipidových tříd. Nejprve se zkoumá účinnost šesti běžných extrakčních protokolů, kde Folchova metoda přináší nejlepší výsledky s ohledem na míru obnovy, maticový efekt a přesnost. Poté se provede úplná optimalizace a analytická validace pro osm lipidových tříd pomocí metod UHPSFC / MS a HILIC-UHPLC / MS pro stejnou sadu vzorků a použije se pro lipidomickou charakterizaci shromážděných vzorků lidské plazmy, lidského séra a NIST SRM 1950 lidská plazma. Volba vhodných interních standardů (IS) pro jednotlivé lipidové třídy má klíčový význam pro spolehlivé kvantitativní pracovní toky ilustrované selektivitou při validaci a výpočtem kvantifikační chyby s použitím více interních standardů na lipidovou třídu. Výsledky validace potvrzují použitelnost obou metod, ale UHPSFC / MS poskytuje některé výrazné výhody, jako je úspěšná separace nepolárních a polárních lipidových tříd na rozdíl od HILIC-UHPLC / MS, kratší celkové doby běhu (8 vs. 10,5 min ) a mírně vyšší robustnost. Různé typy korelací mezi metodami (UHPSFC / MS a HILIC-UHPLC / MS), biologickým materiálem (plazma a sérum), IS (laboratorní a komerčně dostupné směsi) a literárními údaji o standardním referenčním materiálu ukazují intra- a mezilaboratorní srovnání v kvantifikaci lipidových druhů z osmi lipidových tříd, rozdíly v koncentraci v séru a plazmě, jakož i použitelnost nekomerčně dostupných směsí vnitřních standardů pro kvantifikaci lipidů

Intralaboratorní srovnání čtyř analytických platforem pro lipidomickou kvantifikaci pomocí hydrofilní interakční kapalinové chromatografie nebo superkritické kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií kvadrupól – analyzátor doby letu

The lipidomic research is currently devoting considerable effort to the harmonization that should enable the generation of comparable and accurate quantitative lipidomic data across different laboratories and regardless of the mass spectrometry-based platform used. In the present study, we systematically investigate the effects of the experimental setup on quantitative lipidomics data obtained by two lipid class separation approaches, hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) and ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography (UHPSFC), coupled to two different quadrupole - time of flight (QTOF) mass spectrometers from the same vendor. This approach is applied for measurements of 268 human plasma samples of healthy volunteers and renal cell carcinoma patients resulting in four data sets. We investigate and visualize differences among these data sets by multivariate data analysis methods, such as principal component analysis (PCA), orthogonal partial least square discriminant analysis (OPLS-DA), box plots, and logarithmic correlations of molar concentrations of individual lipid species. The results indicate that even measurements in the same laboratory for the same samples using different analytical platforms may yield slight variations in the molar concentrations determined. The normalization to a reference sample with defined lipid concentrations can further diminish these small differences, resulting in highly homogenous molar concentrations of individual lipid species. This strategy indicates a potential approach towards the reporting of comparable quantitative results independent from the quantitative approach and mass spectrometer used, which is important for a wider acceptance of lipidomics data in various biomarker inter-laboratory studies and ring trials.Lipidomický výzkum v současné době věnuje značné úsilí harmonizaci, která by měla umožnit generování srovnatelných a přesných kvantitativních lipidomických údajů napříč různými laboratořemi a bez ohledu na použitou platformu založenou na hmotnostní spektrometrii. V současné studii systematicky zkoumáme účinky experimentálního nastavení na kvantitativní lipidomické údaje získané dvěma přístupy k oddělení lipidových tříd, hydrofilní interakční kapalinovou chromatografií (HILIC) a ultra-vysokoúčinnou superkritickou kapalinovou chromatografií (UHPSFC) spojenými se dvěma různými hmotnostními spektrometry kvadrupól – analyzátor dobry letu (QTOF) od stejného dodavatele. Tento přístup je aplikován na měření 268 vzorků lidské plazmy od zdravých dobrovolníků a pacientů s karcinomem ledvin, z nichž vyplývají čtyři soubory údajů. Zkoumáme a vizualizujeme rozdíly mezi těmito soubory dat pomocí multivariačních metod analýzy dat, jako je analýza hlavních komponent (PCA), ortogonální diskriminační analýza částečných nejmenších čtverců (OPLS-DA), krabicové grafy a logaritmické korelace molárních koncentrací jednotlivých druhů lipidů. Výsledky ukazují, že i měření v téže laboratoři pro stejné vzorky za použití různých analytických platforem mohou přinést mírné odchylky ve stanovených molárních koncentracích. Normalizace na referenční vzorek s definovanými koncentracemi lipidů může dále snížit tyto malé rozdíly, což vede k vysoce homogenním molárním koncentracím jednotlivých lipidů. Tato strategie naznačuje potenciální přístup k vykazování srovnatelných kvantitativních výsledků nezávislý na kvantitativním přístupu a použitém hmotnostním spektrometru, což je důležité pro širší přijetí lipidomických údajů v různých biomarkerových mezilaboratorních studiích a kruhových studiích

Komplexní identifikace glykosfingolipidů v lidské plazmě pomocí hydrofilní interakční kapalinové chromatografie – hmotnostní spektrometrie s elektrosprejovou ionizací

Glycosphingolipids (GSL) represent a highly heterogeneous class of lipids with many cellular functions, implicated in a wide spectrum of human diseases. Their isolation, detection, and comprehensive structural analysis is a challenging task due to the structural diversity of GSL molecules. In this work, GSL subclasses are isolated from human plasma using an optimized monophasic ethanol–water solvent system capable to recover a broad range of GSL species. Obtained deproteinized plasma is subsequently purified and concentrated by C18-based solid-phase extraction (SPE). The hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to electrospray ionization linear ion trap tandem mass spectrometry (HILIC-ESI-LIT-MS/MS) is used for GSL analysis in the human plasma extract. Our results provide an in-depth profiling and structural characterization of glycosph- ingolipid and some phospholipid subclasses identified in the human plasma based on their retention times and the interpretation of tandem mass spectra. The structural composition of particular lipid species is readily characterized based on the detailed interpretation of mass spectrometry (MS) and tandem mass spectrometry (MS/MS) spectra and further confirmed by specific fragmentation behavior following predictable patterns, which yields to the unambiguous identification of 154 GSL species within 7 lipid subclasses and 77 phospholipids representing the highest number of GSL species ever reported in the human plasma. The developed HILIC-ESI-MS/MS method can be used for further clinical and biological research of GSL in the human blood or other biological samples.Glykosfingolipidy (GSL) představují vysoce heterogenní třídu lipidů s mnoha buněčnými funkcemi, implikovanými do širokého spektra lidských onemocnění. Jejich izolace, detekce a komplexní strukturní analýza je náročným úkolem vzhledem ke strukturní rozmanitosti molekul GSL. V této práci jsou podtřídy GLS izolovány z lidské plazmy pomocí optimalizovaného monofázického systému rozpouštědla ethanol-voda schopného obnovit širokou škálu GSL. Získaná deproteinizovaná plazma se následně čistí a koncentruje extrakcí na pevné fázi na bázi C18 (SPE). Hydrofilní interakční kapalinová chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií s elektrosprejovou ionizací a lineání iontovou pastí (HILIC-ESI-LIT-MS/MS) se používá pro analýzu GSL v lidském extraktu plazmy. Naše výsledky poskytují hloubkové profilování a strukturní charakterizaci glykosfingolipidu a některých fosfolipidových podtříd identifikovaných v lidské plazmě na základě jejich retenčních časů a interpretace tandemových hmotnostních spekter. Strukturní složení jednotlivých lipidů je snadno charakterizováno na základě podrobné interpretace hmotnostně spektrometrických (MS) a tandemových hmotnostně spektrometrických (MS/MS) spekter a dále potvrzeno specifickým fragmentačním chováním podle předvídatelných vzorců, což vede k jednoznačné identifikaci 77 fosfolipidů a 154 GSL v rámci 7 lipidových podtříd představujících nejvyšší počet GSL, který byl kdy v lidské plazmě hlášen. Vyvinutá metoda HILIC-ESI-MS/MS může být použita pro další klinický a biologický výzkum GSL v lidské krvi nebo jiných biologických vzorcích

Retenční závislosti podporují spolehlivou identifikaci lipidů v reverzní UHPLC/MS lidské plazmy

Reversed-phase ultrahigh-performance liquid chromatography-mass spectrometry (RP-UHPLC/MS) method was developed with the aim to unambiguously identify a large number of lipid species from multiple lipid classes in human plasma. The optimized RP-UHPLC/MS method employed the C18 column with sub-2-μm particles with the total run time of 25 min. The chromatographic resolution was investigated with 42 standards from 18 lipid classes. The UHPLC system was coupled to high- resolution quadrupole-time-of-flight (QTOF) mass analyzer using electrospray ionization (ESI) measuring full-scan and tandem mass spectra (MS/MS) in positive- and negative-ion modes with high mass accuracy. Our identification approach was based on m/z values measured with mass accuracy within 5 ppm tolerance in the full-scan mode, characteristic fragment ions in MS/MS, and regularity in chromatographic retention dependences for individual lipid species, which provides the highest level of confidence for reported identifications of lipid species including regioisomeric and other isobaric forms. The graphs of depen- dences of retention times on the carbon number or on the number of double bond(s) in fatty acyl chains were constructed to support the identification of lipid species in homologous lipid series. Our list of identified lipid species is also compared with previous publications investigating human blood samples by various MS-based approaches. In total, we have reported more than 500 lipid species representing 26 polar and nonpolar lipid classes detected in NIST Standard reference material 1950 human plasma.Metoda reverzní ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií (RP-UHPLC/MS) byla vyvinuta s cílem jednoznačně identifikovat velké množství lipidů z více lipidových tříd v lidské plazmě. Optimalizovaná metoda RP-UHPLC/MS použila kolonu C18 se sub-2-μm částicemi s celkovou dobou analýzy 25 min. Chromatografické rozlišení bylo zkoumáno se 42 standardy z 18 lipidových tříd. Systém UHPLC byl spojen s hybridním kvadrupólovým analyzátorem – analyzátorem doby letu (QTOF) s vysokým rozlišením, který využíval ionizaci elektrosprejem (ESI) a měřil hmotnostní spektrum úplného skenu a tandemová hmotnostní spektra (MS/MS) v pozitivních a negativních iontových režimech s vysokou hmotnostní přesností. Náš identifikační přístup byl založen na hodnotách m/z naměřených s hmotnostní přesností do 5 ppm tolerance v režimu úplného skenování, charakteristických fragmentových iontech v MS/MS a pravidelnosti v chromatografických závislostech na retenci jednotlivých lipidů, což poskytuje nejvyšší úroveň spolehlivosti pro referovanou identifikaci lipidů včetně regioizomerních a jiných izobarických forem. Grafy závislosti retenčních časů na počtu uhlíků nebo na počtu dvojných vazeb v mastných acylových řetězcích byly sestrojeny tak, aby podporovaly identifikaci lipidů v homologních lipidových řadách. Náš seznam identifikovaných lipidů je také porovnáván s předchozími publikacemi zkoumajícími vzorky lidské krve pomocí různých přístupů založených na MS. Celkem jsme nahlásili více než 500 lipidů reprezentujících 26 polárních a nepolárních lipidových tříd detekovaných ve standardním referenčním materiálu NIST 1950 lidské plazmy