MIF/CXCR4 signaling axis contributes to survival, invasion, and drug resistance of metastatic neuroblastoma cells in the bone marrow microenvironment

Background: The bone marrow (BM) is the most common site of dissemination in patients with aggressive, metastatic neuroblastoma (NB). However, the molecular mechanisms underlying the aggressive behavior of NB cells in the BM niche are still greatly unknown. In the present study, we explored biological mechanisms that play a critical role in NB cell survival and progression in the BM and investigated potential therapeutic targets. Methods: Patient-derived bone marrow (BM) primary cultures were generated using fresh BM aspirates obtained from NB patients. NB cell lines were cultured in the presence of BM conditioned media containing cell-secreted factors, and under low oxygen levels (1% O2) to mimic specific features of the BM microenvironment of high-risk NB patients. The BM niche was explored using cytokine profiling assays, cell migration-invasion and viability assays, flow cytometry and analysis of RNA-sequencing data. Selective pharmacological inhibition of factors identified as potential mediators of NB progression within the BM niche was performed in vitro and in vivo. Results: We identified macrophage migration inhibitory factor (MIF) as a key inflammatory cytokine involved in BM infiltration. Cytokine profiling and RNA-sequencing data analysis revealed NB cells as the main source of MIF in the BM, suggesting a potential role of MIF in tumor invasion. Exposure of NB cells to BM-conditions increased NB cell-surface expression of the MIF receptor CXCR4, which was associated with increased cell viability, enhanced migration-invasion, and activation of PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways. Moreover, subcutaneous co-injection of NB and BM cells enhanced tumor engraftment in mice. MIF inhibition with 4-IPP impaired in vitro NB aggressiveness, and improved drug response while delayed NB growth, improving survival of the NB xenograft model. Conclusions: Our findings suggest that BM infiltration by NB cells may be mediated, in part, by MIF-CXCR4 signaling. We demonstrate the antitumor efficacy of MIF targeting in vitro and in vivo that could represent a novel therapeutic target for patients with disseminated high-risk NB

Factors associated with the clinical outcome of patients with relapsed/refractory CD19+acute lymphoblastic leukemia treated with ARI-0001 CART19-cell therapy

The prognosis of patients with relapsed/refractory (R/R) acute lymphoblastic leukemia (ALL) remains poor, particularly for those relapsing after allogeneic hema-topoietic cell transplantation (alloHCT). Novel agents such as inotuzumab ozogamicin or blinatumomab achieve increased response rates, but these are generally transient unless followed by alloHCT. Chimeric antigen receptors (CAR) targeting CD19 have shown promising results in R/R ALL, and one of these products (tisagenlecleucel) has been approved for the treatment of patients with R/R ALL up to 25 years of age

An Extensive Quality Control and Quality Assurance (QC/QA) Program Significantly Improves Inter-Laboratory Concordance Rates of Flow-Cytometric Minimal Residual Disease Assessment in Acute Lymphoblastic Leukemia: An I-BFM-FLOW-Network Report

Monitoring of minimal residual disease (MRD) by flow cytometry (FCM) is a powerful prognostic tool for predicting outcomes in acute lymphoblastic leukemia (ALL). To apply FCM-MRD in large, collaborative trials, dedicated laboratory staff must be educated to concordantly high levels of expertise and their performance quality should be continuously monitored. We sought to install a unique and comprehensive training and quality control (QC) program involving a large number of reference laboratories within the international Berlin-Frankfurt-Münster (I-BFM) consortium, in order to complement the standardization of the methodology with an educational component and persistent quality control measures. Our QC and quality assurance (QA) program is based on four major cornerstones: (i) a twinning maturation program, (ii) obligatory participation in external QA programs (spiked sample send around, United Kingdom National External Quality Assessment Service (UK NEQAS)), (iii) regular participation in list-mode-data (LMD) file ring trials (FCM data file send arounds), and (iv) surveys of independent data derived from trial results. We demonstrate that the training of laboratories using experienced twinning partners, along with continuous educational feedback significantly improves the performance of laboratories in detecting and quantifying MRD in pediatric ALL patients. Overall, our extensive education and quality control program improved inter-laboratory concordance rates of FCM-MRD assessments and ultimately led to a very high conformity of risk estimates in independent patient cohorts

Fratricide-resistant CD1a-specific CAR T cells for the treatment of cortical T-cell acute lymphoblastic leukemia

Relapsed/refractory T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) has a dismal outcome, and no effective targeted immunotherapies for T-ALL exist. The extension of chimeric antigen receptor (CAR) T cells (CARTs) to T-ALL remains challenging because the shared expression of target antigens between CARTs and T-ALL blasts leads to CART fratricide. CD1a is exclusively expressed in cortical T-ALL (coT-ALL), a major subset of T-ALL, and retained at relapse. This article reports that the expression of CD1a is mainly restricted to developing cortical thymocytes, and neither CD34+ progenitors nor T cells express CD1a during ontogeny, confining the risk of on-target/off-tumor toxicity. We thus developed and preclinically validated a CD1a-specific CAR with robust and specific cytotoxicity in vitro and antileukemic activity in vivo in xenograft models of coT-ALL, using both cell lines and coT-ALL patient–derived primary blasts. CD1a-CARTs are fratricide resistant, persist long term in vivo (retaining antileukemic activity in re-challenge experiments), and respond to viral antigens. Our data support the therapeutic and safe use of fratricide-resistant CD1a-CARTs for relapsed/refractory coT-ALL.This research was supported by the European Research Council (H2020) (CoG-2014-646903), the Agencia Estatal de Investigacion/European Re- ´ gional Development Fund (SAF2016-80481-R and SAF2016-75442-R), and the Catalunya Government (SGR330 and PERIS 2017) (P.M.), as well as the Asociacion Española Contra el C ´ ancer, Beca FERO, and the ´ ISCIII/FEDER (PI17/01028) (C.B.). P.M. also acknowledges institutional support from the Obra Social La Caixa-Fundacio Josep Carreras. J.G.P. ` holds a Miguel Servet contract (CP15/00014), and O.B.-L. is supported by an AGAUR-FI fellowship from the Catalan Government. P.M. is an investigator of the Spanish Cell Therapy cooperative network (TERCEL).Peer reviewe

Análisis del valor pronóstico del perfil de expresión génica en la leucemia mieloblástica aguda de riesgo citogenético intermedio según la opción terapéutica post-remisión

ANTECEDENTES DEL TEMA: La leucemia mieloide aguda de riesgo citogenético intermedio (LMA-RI) constituye un grupo heterogéneo desde el punto de vista biológico y pronóstico. La elección del tratamiento post-remisión, basada en una estrategia terapéutica adaptada al riesgo, es por tanto particularmente difícil en esta categoría. HIPÓTESIS: El perfil de expresión génica (PEG) puede identificar nuevos genes con valor pronóstico en pacientes con LMA de riesgo intermedio y contribuir a una elección más racional del tratamiento post-remisión en estos enfermos. OBJETIVOS: 1) Analizar el PEG al diagnóstico de una serie de pacientes con LMA de riesgo citogenético intermedio, en primera remisión completa y sometidos a trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos (auto-TPH); 2) Comparar el PEG según la evolución de los pacientes (recaída vs remisión completa duradera); 3) Validación del conjunto de genes predictivos de la evolución en una población independiente de pacientes de características análogas; 4) Análisis multivariado del valor predictivo del PEG obtenido junto a otras variables clínico-biológicas con valor pronóstico conocido. MÉTODOS: Análisis del PEG en 40 pacientes de LMA sometidos a autotrasplante mediante microarrays HU133A 2.0 plus (Affymetrix), con lectura y normalización de la señal mediante la metodología RMA del paquete Affy (Bioconductor Project). Análisis de los datos mediante el software TM4 Microarrays Software Suite y Limma. En un subgrupo adicional de 49 enfermos se analizó el nivel de expresión, mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real, del conjunto de genes predictivos seleccionado en el análisis previo. Además para la validación de nuestros hallazgos pronósticos, utilizamos datos de una cohorte independiente de 79 pacientes con LMA de cariotipo normal incluidos en el repositorio público del Leukemia Gene Atlas. RESULTADOS: En el estudio supervisado de los datos de expresión de los 40 pacientes tratados con autoTPH se identificaron 75 genes diferencialmente expresados según el pronóstico, con mayor expresión de genes HOX (HOXA4, HOXB2, etc) en el grupo favorable. Mientras que los pacientes que presentaban una recaída temprana mostraron sobreexpresión de determinados genes implicados en la proliferación y apoptosis. Para la validación de los resultados obtenidos se estudió una serie adicional de 49 pacientes. Esta segunda parte del análisis permitió la identificación de 4 genes (BAALC, ALDH2, TP53INP1 y GPR44) asociados con la supervivencia global (SG). Dado el valor pronóstico independiente mostrado por estos cuatro genes, diseñamos un score con los niveles de expresión de dichos genes, capaz de segregar grupos de pacientes con pronósticos marcadamente diferenciados. Cabe destacar que este score mostró un fuerte impacto pronóstico (HR=5.846, IC 95%: 2,157-15,841), independientemente de otras mutaciones con importante valor pronóstico en LMA En una etapa posterior, se confirmó el valor pronóstico de nuestro score en una serie de 79 pacientes con LMA-CN completamente independiente, cuyos datos se obtuvieron de una base de datos de expresión génica pública (http://www.leukemiagene-atlas.org/LGAtlas) (p<0,001; HR=4,45, 95%CI: 1,86-10,6).Además en nuestra serie la sobreexpresión de los genes BAALC, MN1, HOPX y SPARC se asoció a refractariedad. CONCLUSIONES: Mediante el presente trabajo de tesis, hemos podido confirmar la capacidad de los estudios de expresión génica para identificar nuevos biomarcadores y añadir información pronóstica adicional al estudio mutacional en pacientes adultos con LMA y citogenética de riesgo intermedio. El score resultante del nivel de expresión de 4 genes (BAALC, ALDH2, TP53INP1 y GPR44) permite segregar a los pacientes de bajo riesgo de recaída de aquellos pacientes de alto riesgo de recaída y podría usarse para refinar la evaluación pronóstica y guiar el tratamiento posterior a la remisión en los pacientes con LMA-RIIn intermediate-risk cytogenetic acute myeloid leukemia (IRC-AML) patients, novel biomarkers to guide post-remission therapy are needed. We analyzed with high-density arrays 40 IRC-AML patients who received a non-allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation-based post-remission therapy, and identified a signature that correlated with early relapse. Subsequently, we analyzed by RT-PCR 187 selected genes in 49 additional IRC-AML patients. BAALC, MN1, SPARC and HOPX overexpression correlated to refractoriness. BAALC or ALDH2 overexpression correlated to shorter overall survival (OS) (5-year OS: 33±8.6% vs. 73.7±10.1%, p=0.006; 32±9.3% vs. 66.4±9.7%, p=0.016), whereas GPR44 or TP53INP1 overexpression correlated to longer survival (5-year OS: 66.7±10.3% vs. 35.4±9.1%, p=0.04; 58.3±8.2% vs. 23.1±11.7%, p=0.029). A risk-score combining these 4 genes expression distinguished low-risk and high-risk patients (5-year OS: 79±9% vs. 30±8%, respectively; p=0.001) in our cohort and in an independent set of patients from a public repository. Our 4-gene signature may add prognostic information and guide post-remission treatment in IRC-AML patients

Análisis del valor pronóstico del perfil de expresión génica en la leucemia mieloblástica aguda de riesgo citogenético intermedio según la opción terapéutica post-remisión

ANTECEDENTES DEL TEMA: La leucemia mieloide aguda de riesgo citogenético intermedio (LMA-RI) constituye un grupo heterogéneo desde el punto de vista biológico y pronóstico. La elección del tratamiento post-remisión, basada en una estrategia terapéutica adaptada al riesgo, es por tanto particularmente difícil en esta categoría. HIPÓTESIS: El perfil de expresión génica (PEG) puede identificar nuevos genes con valor pronóstico en pacientes con LMA de riesgo intermedio y contribuir a una elección más racional del tratamiento post-remisión en estos enfermos. OBJETIVOS: 1) Analizar el PEG al diagnóstico de una serie de pacientes con LMA de riesgo citogenético intermedio, en primera remisión completa y sometidos a trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos (auto-TPH); 2) Comparar el PEG según la evolución de los pacientes (recaída vs remisión completa duradera); 3) Validación del conjunto de genes predictivos de la evolución en una población independiente de pacientes de características análogas; 4) Análisis multivariado del valor predictivo del PEG obtenido junto a otras variables clínico-biológicas con valor pronóstico conocido. MÉTODOS: Análisis del PEG en 40 pacientes de LMA sometidos a autotrasplante mediante microarrays HU133A 2.0 plus (Affymetrix), con lectura y normalización de la señal mediante la metodología RMA del paquete Affy (Bioconductor Project). Análisis de los datos mediante el software TM4 Microarrays Software Suite y Limma. En un subgrupo adicional de 49 enfermos se analizó el nivel de expresión, mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real, del conjunto de genes predictivos seleccionado en el análisis previo. Además para la validación de nuestros hallazgos pronósticos, utilizamos datos de una cohorte independiente de 79 pacientes con LMA de cariotipo normal incluidos en el repositorio público del Leukemia Gene Atlas. RESULTADOS: En el estudio supervisado de los datos de expresión de los 40 pacientes tratados con autoTPH se identificaron 75 genes diferencialmente expresados según el pronóstico, con mayor expresión de genes HOX (HOXA4, HOXB2, etc) en el grupo favorable. Mientras que los pacientes que presentaban una recaída temprana mostraron sobreexpresión de determinados genes implicados en la proliferación y apoptosis. Para la validación de los resultados obtenidos se estudió una serie adicional de 49 pacientes. Esta segunda parte del análisis permitió la identificación de 4 genes (BAALC, ALDH2, TP53INP1 y GPR44) asociados con la supervivencia global (SG). Dado el valor pronóstico independiente mostrado por estos cuatro genes, diseñamos un score con los niveles de expresión de dichos genes, capaz de segregar grupos de pacientes con pronósticos marcadamente diferenciados. Cabe destacar que este score mostró un fuerte impacto pronóstico (HR=5.846, IC 95%: 2,157-15,841), independientemente de otras mutaciones con importante valor pronóstico en LMA En una etapa posterior, se confirmó el valor pronóstico de nuestro score en una serie de 79 pacientes con LMA-CN completamente independiente, cuyos datos se obtuvieron de una base de datos de expresión génica pública (http://www.leukemiagene-atlas.org/LGAtlas) (p<0,001; HR=4,45, 95%CI: 1,86-10,6).Además en nuestra serie la sobreexpresión de los genes BAALC, MN1, HOPX y SPARC se asoció a refractariedad. CONCLUSIONES: Mediante el presente trabajo de tesis, hemos podido confirmar la capacidad de los estudios de expresión génica para identificar nuevos biomarcadores y añadir información pronóstica adicional al estudio mutacional en pacientes adultos con LMA y citogenética de riesgo intermedio. El score resultante del nivel de expresión de 4 genes (BAALC, ALDH2, TP53INP1 y GPR44) permite segregar a los pacientes de bajo riesgo de recaída de aquellos pacientes de alto riesgo de recaída y podría usarse para refinar la evaluación pronóstica y guiar el tratamiento posterior a la remisión en los pacientes con LMA-RIIn intermediate-risk cytogenetic acute myeloid leukemia (IRC-AML) patients, novel biomarkers to guide post-remission therapy are needed. We analyzed with high-density arrays 40 IRC-AML patients who received a non-allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation-based post-remission therapy, and identified a signature that correlated with early relapse. Subsequently, we analyzed by RT-PCR 187 selected genes in 49 additional IRC-AML patients. BAALC, MN1, SPARC and HOPX overexpression correlated to refractoriness. BAALC or ALDH2 overexpression correlated to shorter overall survival (OS) (5-year OS: 33±8.6% vs. 73.7±10.1%, p=0.006; 32±9.3% vs. 66.4±9.7%, p=0.016), whereas GPR44 or TP53INP1 overexpression correlated to longer survival (5-year OS: 66.7±10.3% vs. 35.4±9.1%, p=0.04; 58.3±8.2% vs. 23.1±11.7%, p=0.029). A risk-score combining these 4 genes expression distinguished low-risk and high-risk patients (5-year OS: 79±9% vs. 30±8%, respectively; p=0.001) in our cohort and in an independent set of patients from a public repository. Our 4-gene signature may add prognostic information and guide post-remission treatment in IRC-AML patients