Evaluación de la línea genéticamente atenuada Li-delta-hsp70-II como vacuna contra la leishmaniosis cutánea y visceral en el modelo ratón

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 23-05-2018Proyecto de Investigación en Salud (PI14/00366) Instituto de Salud Carlos III (Fondos FEDER)  Proyecto de la Unión Europea (7th Framework Programme). Ref. HEALTH‐F3‐2013‐603181

Leishmania infantum (JPCM5) transcriptome, gene models and resources for an active curation of gene annotations

Leishmania infantum is one of the causative agents of visceral leishmaniases, the most severe form of leishmaniasis. An improved assembly for the L. infantum genome was published five years ago, yet delineation of its transcriptome remained to be accomplished. In this work, the transcriptome annotation was attained by a combination of both short and long RNA-seq reads. The good agreement between the results derived from both methodologies confirmed that transcript assembly based on Illumina RNA-seq and further delimitation according to the positions of spliced leader (SAS) and poly-A (PAS) addition sites is an adequate strategy to annotate the transcriptomes of Leishmania, a procedure previously used for transcriptome annotation in other Leishmania species and related trypanosomatids. These analyses also confirmed that the Leishmania transcripts boundaries are relatively slippery, showing extensive heterogeneity at the 5′- and 3′-ends. However, the use of RNA-seq reads derived from the PacBio technology (referred to as Iso-Seq) allowed the authors to uncover some complex transcription patterns occurring at particular loci that would be unnoticed by the use of short RNA-seq reads alone. Thus, Iso-Seq analysis provided evidence that transcript processing at particular loci would be more dynamic than expected. Another noticeable finding was the observation of a case of allelic heterozygosity based on the existence of chimeric Iso-Seq reads that might be generated by an event of intrachromosomal recombination. In addition, we are providing the L. infantum gene models, including both UTRs and CDS regions, that would be helpful for undertaking whole-genome expression studies. Moreover, we have built the foundations of a communal database for the active curation of both gene/transcript models and functional annotations for genes and proteinsThis research was supported by the Spanish Ministerio de Ciencia, Innovación (MICINN), Agencia Estatal deInvestigación(AEI), grant number PID2020-117916RB-I00, and Instituto de Salud Carlos III, grant CB21/13/00018 (CIBERINFEC). An institutional grant from Fundacion RamonAreces is also acknowledge

Analysis of the antigenic and prophylactic properties of the Leishmania translation initiation factors eIF2 and eIF2B in natural and experimental leishmaniasis

Los diferentes miembros de las familias de proteínas intracelulares son reconocidos por el sistema inmunológico del huésped vertebrado infectado por parásitos del género Leishmania. Aquí hemos analizado las propiedades antigénicas e inmunogénicas de los factores de iniciación de la traducción de Leishmania eIF2 y eIF2B. Una búsqueda in silico en las bases de datos de secuencias de Leishmania infantum permitió la identificación de los genes que codifican las subunidades α, β y γ y las subunidades α, β y δ de los supuestos ortólogos de Leishmania de los factores de iniciación eucarióticos F2 (LieIF2) o F2B (LieIF2B), respectivamente. La antigenicidad de estos factores fue analizada por ELISA utilizando versiones recombinantes de las diferentes subunidades. Se encontraron anticuerpos contra las diferentes subunidades LieIF2 y LieIF2B en los sueros de pacientes con leishmaniosis visceral humana y canina, y también en los sueros de hámsteres infectados experimentalmente con L. infantum. En ratones desafiados por L. infantum (BALB/c) y Leishmania major (BALB/c o C57BL/6) se detectó una respuesta humoral moderada contra estos factores proteicos. Cabe destacar que estas proteínas provocaron una producción de IL-10 por parte de los esplenocitos derivados de ratones infectados, independientemente de la especie de Leishmania empleada para el desafío experimental. Cuando se administraron vacunas de ADN basadas en la expresión de los genes codificantes de las subunidades LieIF2 o LieIF2B en ratones, se observó una secreción específica de antígenos de citoquinas IFN-γ e IL-10. Además, se generó en los ratones vacunados una protección parcial contra el desarrollo de la CL murina debido a la infección por L. major. Además, en este trabajo mostramos que la subunidad LieIF2α y las subunidades LieIF2Bβ y δ tienen la capacidad de estimular la secreción de IL-10 por las células del bazo de los ratones ingenuos. Los linfocitos B fueron identificados como los mayores productores de esta citoquina antiinflamatoria. Teniendo en cuenta los datos encontrados en este estudio, se puede formular la hipótesis de que estas proteínas actúan como factores de virulencia implicados en la inducción de respuestas humorales, así como en la producción de la citoquina IL-10 de regulación descendente, favoreciendo un resultado patológico. Por lo tanto, estas proteínas podrían considerarse marcadores de enfermedad.Different members of intracellular protein families are recognized by the immune system of the vertebrate host infected by parasites of the genus Leishmania. Here, we have analyzed the antigenic and immunogenic properties of the Leishmania eIF2 and eIF2B translation initiation factors. An in silico search in Leishmania infantum sequence databases allowed the identification of the genes encoding the α, β, and γ subunits and the α, β, and δ subunits of the putative Leishmania orthologs of the eukaryotic initiation factors F2 (LieIF2) or F2B (LieIF2B), respectively. The antigenicity of these factors was analyzed by ELISA using recombinant versions of the different subunits. Antibodies against the different LieIF2 and LieIF2B subunits were found in the sera from human and canine visceral leishmaniasis patients, and also in the sera from hamsters experimentally infected with L. infantum. In L. infantum (BALB/c) and Leishmania major (BALB/c or C57BL/6) challenged mice, a moderate humoral response against these protein factors was detected. Remarkably, these proteins elicited an IL-10 production by splenocytes derived from infected mice independently of the Leishmania species employed for experimental challenge. When DNA vaccines based on the expression of the LieIF2 or LieIF2B subunit encoding genes were administered in mice, an antigen-specific secretion of IFN-γ and IL-10 cytokines was observed. Furthermore, a partial protection against murine CL development due to L. major infection was generated in the vaccinated mice. Also, in this work we show that the LieIF2α subunit and the LieIF2Bβ and δ subunits have the capacity to stimulate IL-10 secretion by spleen cells from naïve mice. B-lymphocytes were identified as the major producers of this anti-inflammatory cytokine. Taking into account the data found in this study, it may be hypothesized that these proteins act as virulence factors implicated in the induction of humoral responses as well as in the production of the down-regulatory IL-10 cytokine, favoring a pathological outcome. Therefore, these proteins might be considered markers of disease.• Ministerio de Ciencia e Innovación y Fondos FEDER. Proyectos FISPI14/00366, FISPI14/00366 • Fondo de Investigaciones Sanitarias. Proyecto ISCIII-RETICRD16/0027/0008-FEDER • Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Brasil). Program 300174/2014-4 • Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. Ayuda • Fundación Ramón Areces. Ayuda • Banco de Santander. AyudapeerReviewe