Kurz- und Langzeiteffekte ionisierender Strahlung auf die T-Zelllinie Jurkat

Die schädigende Wirkung ionisierender Strahlung auf humane Zellen ist seit Jahrzehnten bekannt und wird besonders in der Strahlentherapie genutzt um gezielt Tumore abzutöten. Neben der gezielten Bestrahlung des Tumorgewebes wird auch immer gesundes Gewebe bestrahlt. Die Auswirkungen dieser subletalen Dosen sind weniger gut erforscht. Die Strahlenhormesis beschreibt Prozesse bei denen geringe Strahlendosen sogar positive Effekte auf Zellen haben können. Besonders Immunzellen scheinen durch die Strahlung angeregt zu werden, da sie nach einer Bestrahlung Tumorgewebe effizienter bekämpfen können (Liu 2006). Im Zusammenhang mit der Immuntherapie ist die Wirkung der Bestrahlung auf Immunzellen von fundamentaler Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wird eine strahleninduzierte Veränderung des Aktivierungszustands der Leukämie T-Zelllinie Jurkat mit den zugrundeliegenden Signalkaskaden untersucht. Eine Bestrahlung von Jurkat Zellen führt zu einer deutlichen morphologischen Änderung und einem veränderten Expressionslevel eines Markers, der für die Aktivierung von T-Zellen charakteristisch ist. In Abhängigkeit von der Dosis vergrößert sich der Zelldurchmesser 48 h nach Bestrahlung. Die Expression von Interleukin-2, einem Zytokin, das bei der normalen Immunantwort infolge einer Aktivierung exprimiert wird, wird hochreguliert. Strahlung bewirkt keine Veränderung der Expression von RNF-128, einem Protein, das T-Zellen exprimieren, wenn sie in den inaktiven Zustand der Anergie wechseln. Obwohl Interleukin-2 hochreguliert wird, konnte keine Zunahme der CD25 Expression nach Bestrahlung beobachtet werden. CD25 wird nur nach einer vollständigen Aktivierung durch Antigen und Costimulus produziert. Die Vermutung, dass eine Signalkaskade über ROS und Calcium, die in vorausgehenden Arbeiten beschrieben wurde, für diese Aktivierung verantwortlich ist, konnte nicht vollends als Ursache bestätigt werden. Mit dem genetisch kodierten H2O2 Sensor HyPer konnte mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung gezeigt werden, dass ionisierende Strahlung das ROS Level in Jurkat Zellen erhöht, wobei die Zellen jedoch einen sehr großen Bereich an H2O2 Änderungen zeigten. Wenn ein Anstieg an H2O2 durch in den Zellen durch extern appliziertes H2O2 nachgeahmt wurde, erhöhte sich die intrazelluläre Calciumkonzentration in einer charakteristischen oszillierenden Art und Weise, die auf einen Calcium induzierte Calcium Freisetzung als Signalantwort schließen lässt. In direkten Messungen der Calciumkonzentration in bestrahlten Jurkat Zellen war es jedoch nicht möglich mit dem chemischen Calciumsensor Fluo-4 eine direkte Auswirkung der Strahlung auf die intrazelluläre Calciumkonzentration innerhalb von wenigen Minuten nach Zusammenfassung 5 Bestrahlung nachzuweisen. Während diese Daten andeuten, dass Calcium keine Rolle in der frühen Reaktion von Zellen auf Strahlung spielt, so zeigen anderen Daten, dass dieser second messenger in späteren Reaktionen beteiligt ist. Mit dem Calciumchelator war es möglich eine strahleninduzierte Vergrößerung der Jurkat Zellen gänzlich zu verhindern. Diese Befunde lassen darauf schließen, dass eine verzögerte Auswirkung des Calciums eine Rolle in dem Prozess der Zellvergrößerung hat. Ein Abfangen der nach Strahlung entstandenen ROS durch ROS scavenger hatte keinen Effekt auf die Vergrößerung. Eine Rolle der ROS für eine Aktivierung konnte ungeachtet dessen durch eine 10 minütige Behandlung mit H2O2 gezeigt werden; in dem Fall ersetzt eine kurze Inkubation der Zellen in H2O2 die Strahlenexposition. Die Versuche zeigen, dass H2O2 zu einer konzentrationsabhängigen Vergrößerung der Zellen führt, die in ihrem Maximum halb so stark wie die maximale Vergrößerung nach einer Bestrahlung war. Eine Vergrößerung in gleichem Maße wie nach einer Behandlung mit H2O2 konnte durch den G2-Zellzyklus Inhibitor RO3306 erreicht werden. Zusammen führen diese Daten zur Hypothese, dass 50 % der Vergrößerung der Jurkat Zellen nach Bestrahlung auf eine Signalkaskade über ROS zustande kommen und die übrigen 50 % aus einem G2- Zellzyklussarrest resultieren. In Kontrollversuchen hatte sich gezeigt, dass die entsprechenden H2O2 Behandlung keinen Einfluss auf einen G2-Zellzyklusarrest haben. Für die Aktivierung von Jurkat Zellen kommt hingegen eine Signalkaskade infrage, die auch durch ROS induzierbar ist, da kein Zusammenhang zwischen einem G2-Arrest und einer veränderten Transkription oder Aktivierung von T-Zellen bekannt ist. Proteine der DNA Reparatur gehören zu den Proteinen, die unmittelbar auf die Bestrahlung reagieren können. Sie sind nicht nur in der Lage DNA-Schäden zu reparieren, sondern können überdies Zellen im Zellzyklus arretieren. Proteine der DNA Reparatur wurden als Auslöser der Aktivierung und Vergrößerung vermutet. Daher wurden DSB Reparaturproteine durch Inhibitoren inaktiviert. Die Inhibition des Reparaturproteins ATR hatten nicht nur zur Folge, dass die strahleninduzierte Vergrößerung verhindert wurde, sondern auch die Arretierung im Zellzyklus teilweise aufgehoben wurde. Letzteres äußerte sich dadurch, dass Jurkat Zellen selbst nach einer Strahlendosis, die ausreicht um einen kompletten Zellzyklusarrest zu initiieren, weiter proliferierten. Dies führt zur Hypothese, dass ionisierende Strahlung durch direkte und indirekte Effekte einzelsträngige Bereiche der DNA erzeugt, wodurch ATR rekrutiert wird, das einerseits einen Zellzyklusarrest initiiert und andererseits eine Vergrößerung und Aktivierung der Jurkat Zellen über zytosolische Signalmoleküle bewirkt. Die Bedeutung des Reparaturproteins ATR für das Zellschicksal ist folglich größer als bisher angenommen. ATR könnte daher das zentrale Protein sein, das für positive Effekte im Zuge der Strahlenhormesis sorgt

Kurz- und Langzeiteffekte ionisierender Strahlung auf die T-Zelllinie Jurkat

Die schädigende Wirkung ionisierender Strahlung auf humane Zellen ist seit Jahrzehnten bekannt und wird besonders in der Strahlentherapie genutzt um gezielt Tumore abzutöten. Neben der gezielten Bestrahlung des Tumorgewebes wird auch immer gesundes Gewebe bestrahlt. Die Auswirkungen dieser subletalen Dosen sind weniger gut erforscht. Die Strahlenhormesis beschreibt Prozesse bei denen geringe Strahlendosen sogar positive Effekte auf Zellen haben können. Besonders Immunzellen scheinen durch die Strahlung angeregt zu werden, da sie nach einer Bestrahlung Tumorgewebe effizienter bekämpfen können (Liu 2006). Im Zusammenhang mit der Immuntherapie ist die Wirkung der Bestrahlung auf Immunzellen von fundamentaler Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wird eine strahleninduzierte Veränderung des Aktivierungszustands der Leukämie T-Zelllinie Jurkat mit den zugrundeliegenden Signalkaskaden untersucht. Eine Bestrahlung von Jurkat Zellen führt zu einer deutlichen morphologischen Änderung und einem veränderten Expressionslevel eines Markers, der für die Aktivierung von T-Zellen charakteristisch ist. In Abhängigkeit von der Dosis vergrößert sich der Zelldurchmesser 48 h nach Bestrahlung. Die Expression von Interleukin-2, einem Zytokin, das bei der normalen Immunantwort infolge einer Aktivierung exprimiert wird, wird hochreguliert. Strahlung bewirkt keine Veränderung der Expression von RNF-128, einem Protein, das T-Zellen exprimieren, wenn sie in den inaktiven Zustand der Anergie wechseln. Obwohl Interleukin-2 hochreguliert wird, konnte keine Zunahme der CD25 Expression nach Bestrahlung beobachtet werden. CD25 wird nur nach einer vollständigen Aktivierung durch Antigen und Costimulus produziert. Die Vermutung, dass eine Signalkaskade über ROS und Calcium, die in vorausgehenden Arbeiten beschrieben wurde, für diese Aktivierung verantwortlich ist, konnte nicht vollends als Ursache bestätigt werden. Mit dem genetisch kodierten H2O2 Sensor HyPer konnte mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung gezeigt werden, dass ionisierende Strahlung das ROS Level in Jurkat Zellen erhöht, wobei die Zellen jedoch einen sehr großen Bereich an H2O2 Änderungen zeigten. Wenn ein Anstieg an H2O2 durch in den Zellen durch extern appliziertes H2O2 nachgeahmt wurde, erhöhte sich die intrazelluläre Calciumkonzentration in einer charakteristischen oszillierenden Art und Weise, die auf einen Calcium induzierte Calcium Freisetzung als Signalantwort schließen lässt. In direkten Messungen der Calciumkonzentration in bestrahlten Jurkat Zellen war es jedoch nicht möglich mit dem chemischen Calciumsensor Fluo-4 eine direkte Auswirkung der Strahlung auf die intrazelluläre Calciumkonzentration innerhalb von wenigen Minuten nach Zusammenfassung 5 Bestrahlung nachzuweisen. Während diese Daten andeuten, dass Calcium keine Rolle in der frühen Reaktion von Zellen auf Strahlung spielt, so zeigen anderen Daten, dass dieser second messenger in späteren Reaktionen beteiligt ist. Mit dem Calciumchelator war es möglich eine strahleninduzierte Vergrößerung der Jurkat Zellen gänzlich zu verhindern. Diese Befunde lassen darauf schließen, dass eine verzögerte Auswirkung des Calciums eine Rolle in dem Prozess der Zellvergrößerung hat. Ein Abfangen der nach Strahlung entstandenen ROS durch ROS scavenger hatte keinen Effekt auf die Vergrößerung. Eine Rolle der ROS für eine Aktivierung konnte ungeachtet dessen durch eine 10 minütige Behandlung mit H2O2 gezeigt werden; in dem Fall ersetzt eine kurze Inkubation der Zellen in H2O2 die Strahlenexposition. Die Versuche zeigen, dass H2O2 zu einer konzentrationsabhängigen Vergrößerung der Zellen führt, die in ihrem Maximum halb so stark wie die maximale Vergrößerung nach einer Bestrahlung war. Eine Vergrößerung in gleichem Maße wie nach einer Behandlung mit H2O2 konnte durch den G2-Zellzyklus Inhibitor RO3306 erreicht werden. Zusammen führen diese Daten zur Hypothese, dass 50 % der Vergrößerung der Jurkat Zellen nach Bestrahlung auf eine Signalkaskade über ROS zustande kommen und die übrigen 50 % aus einem G2- Zellzyklussarrest resultieren. In Kontrollversuchen hatte sich gezeigt, dass die entsprechenden H2O2 Behandlung keinen Einfluss auf einen G2-Zellzyklusarrest haben. Für die Aktivierung von Jurkat Zellen kommt hingegen eine Signalkaskade infrage, die auch durch ROS induzierbar ist, da kein Zusammenhang zwischen einem G2-Arrest und einer veränderten Transkription oder Aktivierung von T-Zellen bekannt ist. Proteine der DNA Reparatur gehören zu den Proteinen, die unmittelbar auf die Bestrahlung reagieren können. Sie sind nicht nur in der Lage DNA-Schäden zu reparieren, sondern können überdies Zellen im Zellzyklus arretieren. Proteine der DNA Reparatur wurden als Auslöser der Aktivierung und Vergrößerung vermutet. Daher wurden DSB Reparaturproteine durch Inhibitoren inaktiviert. Die Inhibition des Reparaturproteins ATR hatten nicht nur zur Folge, dass die strahleninduzierte Vergrößerung verhindert wurde, sondern auch die Arretierung im Zellzyklus teilweise aufgehoben wurde. Letzteres äußerte sich dadurch, dass Jurkat Zellen selbst nach einer Strahlendosis, die ausreicht um einen kompletten Zellzyklusarrest zu initiieren, weiter proliferierten. Dies führt zur Hypothese, dass ionisierende Strahlung durch direkte und indirekte Effekte einzelsträngige Bereiche der DNA erzeugt, wodurch ATR rekrutiert wird, das einerseits einen Zellzyklusarrest initiiert und andererseits eine Vergrößerung und Aktivierung der Jurkat Zellen über zytosolische Signalmoleküle bewirkt. Die Bedeutung des Reparaturproteins ATR für das Zellschicksal ist folglich größer als bisher angenommen. ATR könnte daher das zentrale Protein sein, das für positive Effekte im Zuge der Strahlenhormesis sorgt

Ionizing Radiation Induces Morphological Changes and Immunological Modulation of Jurkat Cells

Impairment or stimulation of the immune system by ionizing radiation (IR) impacts on immune surveillance of tumor cells and non-malignant cells and can either foster therapy response or side effects/toxicities of radiation therapy. For a better understanding of the mechanisms by which IR modulates T-cell activation and alters functional properties of these immune cells, we exposed human immortalized Jurkat cells and peripheral blood lymphocytes (PBL) to X-ray doses between 0.1 and 5 Gy. This resulted in cellular responses, which are typically observed also in naïve T-lymphocytes in response of T-cell receptor immune stimulation or mitogens. These responses include oscillations of cytosolic Ca2+, an upregulation of CD25 surface expression, interleukin-2 and interferon-γ synthesis, elevated expression of Ca2+ sensitive K+ channels and an increase in cell diameter. The latter was sensitive to inhibition by the immunosuppressant cyclosporine A, Ca2+ buffer BAPTA-AM, and the CDK1-inhibitor RO3306, indicating the involvement of Ca2+-dependent immune activation and radiation-induced cell cycle arrest. Furthermore, on a functional level, Jurkat and PBL cell adhesion to endothelial cells was increased upon radiation exposure and was highly dependent on an upregulation of integrin beta-1 expression and clustering. In conclusion, we here report that IR impacts on immune activation and functional properties of T-lymphocytes that may have implications in both toxic effects and treatment response to combined radiation and immune therapy in cancer patients

X-ray irradiation activates K+^+ channels via H2_2O2_2 signaling

Ionizing radiation is a universal tool in tumor therapy but may also cause secondary cancers or cell invasiveness. These negative side effects could be causally related to the human-intermediate-conductance Ca(2+)-activated-K(+)-channel (hIK), which is activated by X-ray irradiation and affects cell proliferation and migration. To analyze the signaling cascade downstream of ionizing radiation we use genetically encoded reporters for H(2)O(2) (HyPer) and for the dominant redox-buffer glutathione (Grx1-roGFP2) to monitor with high spatial and temporal resolution, radiation-triggered excursions of H(2)O(2) in A549 and HEK293 cells. The data show that challenging cells with ≥1 Gy X-rays or with UV-A laser micro-irradiation causes a rapid rise of H(2)O(2) in the nucleus and in the cytosol. This rise, which is determined by the rate of H(2)O(2) production and glutathione-buffering, is sufficient for triggering a signaling cascade that involves an elevation of cytosolic Ca(2+) and eventually an activation of hIK channels

X-ray irradiation activates K(+) channels via H2O2 signaling.

Ionizing radiation is a universal tool in tumor therapy but may also cause secondary cancers or cell invasiveness. These negative side effects could be causally related to the human-intermediate-conductance Ca(2+)-activated-K(+)-channel (hIK), which is activated by X-ray irradiation and affects cell proliferation and migration. To analyze the signaling cascade downstream of ionizing radiation we use genetically encoded reporters for H2O2 (HyPer) and for the dominant redox-buffer glutathione (Grx1-roGFP2) to monitor with high spatial and temporal resolution, radiation-triggered excursions of H2O2 in A549 and HEK293 cells. The data show that challenging cells with ≥1 Gy X-rays or with UV-A laser micro-irradiation causes a rapid rise of H2O2 in the nucleus and in the cytosol. This rise, which is determined by the rate of H2O2 production and glutathione-buffering, is sufficient for triggering a signaling cascade that involves an elevation of cytosolic Ca(2+) and eventually an activation of hIK channels

X-ray irradiation triggers immune response in human T-lymphocytes via store-operated Ca2+Ca^{2+} entry and NFAT activation

Radiation therapy efficiently eliminates cancer cells and reduces tumor growth. To understand collateral agonistic and antagonistic effects of this treatment on the immune system, we examined the impact of x-ray irradiation on human T cells. We find that, in a major population of leukemic Jurkat T cells and peripheral blood mononuclear cells, clinically relevant radiation doses trigger delayed oscillations of the cytosolic Ca2+ concentration. They are generated by store-operated Ca2+ entry (SOCE) following x-ray-induced clustering of Orai1 and STIM1 and formation of a Ca2+ release-activated Ca2+ (CRAC) channel. A consequence of the x-ray-triggered Ca2+ signaling cascade is translocation of the transcription factor nuclear factor of activated T cells (NFAT) from the cytosol into the nucleus, where it elicits the expression of genes required for immune activation. The data imply activation of blood immune cells by ionizing irradiation, with consequences for toxicity and therapeutic effects of radiation therapy

image_1_Ionizing Radiation Induces Morphological Changes and Immunological Modulation of Jurkat Cells.tiff

<p>Impairment or stimulation of the immune system by ionizing radiation (IR) impacts on immune surveillance of tumor cells and non-malignant cells and can either foster therapy response or side effects/toxicities of radiation therapy. For a better understanding of the mechanisms by which IR modulates T-cell activation and alters functional properties of these immune cells, we exposed human immortalized Jurkat cells and peripheral blood lymphocytes (PBL) to X-ray doses between 0.1 and 5 Gy. This resulted in cellular responses, which are typically observed also in naïve T-lymphocytes in response of T-cell receptor immune stimulation or mitogens. These responses include oscillations of cytosolic Ca²⁺, an upregulation of CD25 surface expression, interleukin-2 and interferon-γ synthesis, elevated expression of Ca²⁺ sensitive K⁺ channels and an increase in cell diameter. The latter was sensitive to inhibition by the immunosuppressant cyclosporine A, Ca²⁺ buffer BAPTA-AM, and the CDK1-inhibitor RO3306, indicating the involvement of Ca²⁺-dependent immune activation and radiation-induced cell cycle arrest. Furthermore, on a functional level, Jurkat and PBL cell adhesion to endothelial cells was increased upon radiation exposure and was highly dependent on an upregulation of integrin beta-1 expression and clustering. In conclusion, we here report that IR impacts on immune activation and functional properties of T-lymphocytes that may have implications in both toxic effects and treatment response to combined radiation and immune therapy in cancer patients.</p