Ultrafiltração da surfactina e manosileritritol lipídeos produzidos com manipueira como substrato

Orientadores: Glaucia Maria Pastore, Francisco Fábio Cavalcante BarrosTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: A implantação de processos biotecnológicos incluindo a produção de enzimas, peptídeos, bioaromas, biossurfactantes, entre outros, tem aumentado de forma relevante. De modo geral, o processo de purificação representa ? 60% do custo de produção de biossurfactantes, enquanto o meio de cultura ? 30%. Este estudo descreve, pela primeira vez, a ultrafiltração de dois biossurfactantes (estudos independentes) que foram produzidos com resíduo agroindustrial como meio de cultura, ou seja, surfactina por Bacillus subtilis LB5a e manosileritritol lipídeos por Pseudozyma tsukubaensis, ambos usando manipueira como meio de cultura. A surfactina foi produzida por Bacillus subtilis LB5a em bioreator (3 litros de volume de trabalho). A espuma (alto teor de surfactina) foi coletada pelo topo do bioreator e utilizada para os cálculos de rendimento do processo e avaliação da purificação por ultrafiltração. Foram produzidos ? 336,66 mg de surfactina por litro de meio de cultura. A ultrafiltração da surfactina foi realizada em duas etapas nas quais (i) as micelas de surfactinas foram retidas e, (ii) a adição de solvente orgânico (etanol) provocou a desestabilização das micelas de surfactina, permitindo que as moléculas de surfactina livres (não agregadas) fossem recuperadas no permeado. O processo de ultrafiltração utilizou membranas de polietersulfônica com dois pontos de corte molar, 100 kDa e 50 kDa. Sendo a melhor estratégia à utilização da membrana de 100 kDa na primeira etapa de ultrafiltração e 50 kDa na segunda etapa de ultrafiltração. A ultrafiltração do biossurfactante bruto foi associada com incrustação e/ou polarização por concentração. No entanto, a ultrafiltração do biossurfactante semipurificado resultou em alta recuperação da surfactina (78,25%) com elevada separação das proteínas e redução dos efeitos de incrustação e polarização por concentração. Assim, por um lado o uso de manipueira para a produção de surfactina reduz o custo de produção. Por outro lado, dificulta o processo de purificação. Visto que as etapas de produção, purificação e aplicação devem ser avaliadas sequencialmente, o uso da manipueira como meio de cultura deve ser integrado a um tratamento para a retirada das proteínas da manipueira antes do processo fermentativo, ou anteriormente as etapas de ultrafiltração (teor de proteínas reduzido), como por exemplo a precipitação ácida e extração por solvente orgânico, ou ainda por processos de purificação alternativos a ultrafiltração, como por exemplo a coluna de bolhas. A identificação estrutural química da surfactina foi realizada por duas análises, (i) ionização por dessorção a laser assistida por matriz seguida pela detecção em um analisador do tipo tempo de vôo e, (ii) espectroscopia de ressônancia nuclear magnética. Atráves destas técnicas foram identificadas 11 isoformas potenciais de surfactina, que por sua vez foram compostas por duas sequências de aminoácidos (Glu1-Leu2-Leu3-Val4-Asp5-Leu6-Leu7) e (Glu1'-Leu2'-Leu3'-Val4'-Asp5'-Leu6'-Val7'). Os manosileritritol lipídeos foram produzidos por Pseudozyma tsukubaensis em bioreator (3 litros de volume de trabalho) usando manipueira como meio de cultura. A espuma (alto teor de manosileritritol lipídeos) foi coletada pelo topo do bioreator e utilizada para os cálculos de rendimento do processo e avaliação da purificação por ultrafiltração. Foram produzidos ? 1,26 g de manosileritritol lipídeos por litro de meio de cultura, mostrando que a manipueira é um meio de cultura adequado a produção de manosileritritol lipídeos por Pseudozyma tsukubaensis. Os experimentos de ultrafiltração com os manosileritritol lipídeos, removeram ? 95% de proteínas e retiveram (vesículas) ? 80% dos manosileritritol lipídeos. Portanto, uma única etapa de ultrafiltração foi necessária para a purificação dos manosileritritol lipídeos. O processo de ultrafiltração foi escalonado de 20 mL (dispositivo de centrifugação) para 500 mL (equipamento de ultrafiltração de bancada), e os resultados não mostraram disparidade. A produção de manosileritritol lipídeos-B pela linhagem de Pseudozyma tsukunbaensis foi confirmada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa, ionização por dessorção a laser assistida por matriz seguida pela detecção em um analisador do tipo tempo de vôo e espectroscopia de ressônancia nuclear magnética, sendo também identificado um segundo estereoisômeros (? 9%) relacionado ao eritritol. A recuperação de manosileritritol lipídeos-B pela formação e arraste de espuma no bioreator integrada à ultrafiltração é uma notável alternativa de purificação, ao invés da convencional extração com acetato de etila seguido da purificação em coluna de sílica. Após estabelecer a produção e purificação de biossurfactantes, esses compostos foram avaliados quanto ao seu potencial para a recuperação avançada de petróleo. Os experimentos foram realizados com 3 tipos de petróleo, leve, médio e pesado. Baseado nos resultados obtidos nos testes de deslocamento de óleo e índice de emulsão, manosileritritol lipídeos-B são mais eficientes para o processo de recuperação avançada de petróleo do que a surfactina, em particular para o petróleo pesadoAbstract: The set of biotechnological processes including the production of enzymes, peptides, bioflavours, biosurfactants, among other, is significantly increasing. In general, the purification process represents ? 60% of production cost of biosurfactants, whereas the culture medium ? 30%. This study describes, for the first time, the ultrafiltration of two biosurfactants (independent studies), which were produced using an industrial waste as culture medium, that is, surfactin by Bacillus subtilis LB5a and mannosylerythritol lipids by Pseudozyma tsukubaensis. Surfactin was produced by Bacillus subtilis LB5a at top-bench bioreactor scale (3 liters of working volume). The foam (high concentration of surfactin) was collected by the top of bioreactor and used for the calculations of yield of process and evaluation of purification by ultrafiltration. The yield was ? 366.66 mg of surfactin by liter of culture medium. The ultrafiltration of surfactin was carried out in two-steps (i) the micelles were retained and, (ii) the adition of organic solvent (ethanol) destabilized the surfactin micelles, allowing the free surfactin (unaggregated) be recovered in the permeate. For the process of ultrafiltration, polyethersulfone membranes with two molecular weight cut-off, 100 kDa and 50 kDa, were used. The best strategy was the use of membrane of 100 kDa in the first step of ultrafiltration and 50 kDa in the second step of ultrafiltration. The ultrafiltration of crude biosurfactant was associated with fouling and/or concentration polarization. However, the ultrafiltration of semi-purified biosurfactant resulted in high recovery of surfactin (78.25%), high sepration from proteins and reduced effects of fouling and/or concentration polarization. Thus, on one hand the use of cassava wastewater for the production of surfactin decreases the production costs. On the other hand, makes harder the purification process. Since the steps of production, purification and application should be evaluated sequentially, the use of cassava wastewater has to be integrated to a treatment for remove the proteins before the fermentation process, or before the ultrafiltration steps (lower concentration of proteins), for instance acid precipitation and extraction by organic solvent, or even alternative process of purification, for instance bubble column. The chemical structure identification of surfactin was carried out by two analyses: (i) matrix assisted lazer desorption ionization followed by the detection using analyzer of time of flight and, (ii) nuclear magnetic resonance spectroscopy. By the analyses of these two techniques were identified 11 potential isoforms of surfactin, in which are composed by two sequences of amino acids (Glu1-Leu2-Leu3-Val4-Asp5-Leu6-Leu7) and (Glu1'-Leu2'-Leu3'-Val4'-Asp5'-Leu6'-Val7'). Mannosylerythritol lipids were produced by Pseudozyma tsukubaensis at top-bench bioreactor scale (3 liters of working volume) using cassava wastewater as culture medium. The foam (high concentration of mannosylerythritol lipids) was collected by the top of bioreactor and used for the calculations of yield of process and evaluation of purification by ultrafiltration. The yield was ? 1.23 g of mannosylerythritol lipids by liter of culture medium, which demonstrates that cassava wastewater is a good culture medium for the production of mannosylerythritol lipids by Pseudozyma tsukubaensis. The experiments of ultrafiltration with mannosylerythritol lipids removed ? 95% of proteins and retained (vesicles) ? 80% of mannosylerythritol lipids. Therefore, only one step of ultrafiltration was needed for the purification of mannosylerythritol lipids. The process of ultrafiltration was scaled-up from 20 mL (ultrafiltration device) to 500 mL (top-bench ultrafiltration equipment), and the results were similar. The production of mannosylerythritol lipids-B by Pseudozyma tsukunbaensis was confirmed by gas chromatography coupled to mass spectrometry, matrix assisted lazer desorption ionization followed by the detection using analyzer of time of flight and nuclear magnetic resonance spectroscopy. It was also identified a second stereoisomer (? 9%) related to erythritol. The recovery of mannosylerythritol lipids-B by the foam overflow on the top of bioreactor integrated to ultrafiltration is a remarkable alternative of purification, instead of the traditional extraction using ethyl acetate followed of silica column. After the production and purification of biosurfactants, their potentials for enhanced oil recovery were evaluated. The experiments were carried out with 3 sorts of oils, light, medium and heavy. According to the results obtained of oil displacement and emulsification index tests, mannosylerythritol lipids-B are more efficient on microbial enhanced oil recovery, em particular for heavy oilDoutoradoCiência de AlimentosDoutor em Ciência de Alimentos2011/22776-5, 2012/20982-0FAPES

Study of the use glycerol from the biodiesel production by Bacillus subtilis for the production of biosurfactants, enzymes and

Orientador: Glaucia Maria PastoreDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: Os parâmetros ótimos de desodorização (temperatura, porcentagem de vapor e pressão de operação) são determinados de acordo com o tipo de óleo e o processo de refino selecionado. O refino do óleo de palma é realizado preferencialmente através do refino físico, pois sua elevada acidez pode provocar uma perda excessiva de óleo neutro no caso da utilização do refino químico. O refino físico de óleos vegetais consiste num processo de esgotamento ou stripping, no qual sob pressões reduzidas e elevadas temperaturas os compostos voláteis são removidos do óleo neutro através da utilização de um agente de arraste, que pode ser um gás ou vapor. No entanto, estas condições de processo também facilitam a ocorrência de volatilização de valiosos compostos minoritários como esqualeno, tocoferóis, tocotrienóis, fitoesteróis, bem como uma pequena porção dos acilgliceróis. Desta forma, este trabalho apresenta a aplicação da metodologia de superfície de resposta (MSR) no estudo dos efeitos de três variáveis de processo (temperatura, porcentagem de vapor e fração estearina/oleína), sobre a perda/transferência de compostos graxos durante a desacidificação física. As respostas de interesse foram acidez final do óleo e perda de óleo neutro (PON). Os resultados revelaram que a composição do óleo é um fator importante e estatisticamente significante a ser considerado na seleção de variáveis de processo mais adequadas, além da temperatura e da porcentagem de vapor. Na segunda etapa, foi realizado um estudo detalhado da degradação térmica dos carotenóides no óleo de palma considerando-se temperaturas variando na faixa de 170 ºC a 230 ºC. O processo de aquecimento foi realizado com injeção de nitrogênio e a coleta de amostra foi feita a cada 20 min durante um período de aquecimento total de 140 min. Os dados experimentais foram então comparados com dados da literatura relacionados à degradação de carotenóides. A degradação térmica dos carotenóides mostrou uma melhor adequação a uma ordem de reação superior a 1. Em uma etapa posterior, a metodologia de superfície de resposta (MSR) foi aplicada para o refino físico de amostras de óleo de palma de diferentes qualidades, medidas através de sua acidez inicial. Foram consideradas a influência de duas condições de operação e um terceiro parâmetro de qualidade, sendo estes: temperatura, porcentagem de vapor e acidez inicial das amostras. As respostas de interesse foram acidez final do óleo, retenção de tocóis, perda de óleo neutro (PON) e retenção de carotenóides. Os resultados mostraram que a acidez inicial é um parâmetro estatisticamente importante para a obtenção de valores aceitáveis de acidez final. Este parâmetro está diretamente relacionado à concentração de componentes minoritários no óleo, pois caso o valor de acidez final não tenha atendido aos padrões pré-determinados, o óleo deve ser submetido a tratamentos subseqüentes utilizando-se temperaturas mais elevadas ou maiores tempo de processo, portanto, acarretando a redução dos compostos minoritários. Para finalizar este trabalho foi avaliada a ocorrência da reação de hidrólise de óleo neutro durante o processo de desacidificação física. Os resultados revelaram que as maiores concentrações de ácidos graxos livres (AGL) no óleo e as menores concentrações de AGL no destilado foram obtidas para as maiores vazões de vapor e menores tempos de processo. Observou-se também, que a geração de AGL aumenta com o aumento da porcentagem de vapor e da temperatura do processo. Através da análise da cinética da hidrólise de óleo neutro, foi possível verificar uma boa adequação dos dados à equação de primeira-ordemAbstract: Optimal deodorizing parameters (temperature, steam percentage, and operating pressure) are determined by the type of oil and the selected refining process. Refining of palm oil is preferably performed by physical means since its high acidity can lead to excessive losses of neutral oil in case of the caustic refining process. Physical refining of vegetable oils is a stripping process in which, under low absolute pressure and high temperatures, the accompanying lower boiling compounds are distilled off from neutral oil, by using gas or steam, as effective stripping agent. However, these processing conditions also increase the occurrence of volatilization of the valuable minor components present in the oil such as squalene, tocopherols, phytosterols, as well as some portion of acylglycerols. Thus, this work presents the application of response surface methodology (RSM) to the study of the effects of three factors (temperature, percentage of stripping steam and the stearin/olein ratio) on the losses/transfer of fatty compounds during the steam deacidification. The responses of interest were the final oil acidity and the loss of neutral oil (NOL). The results revealed that the oil composition was an important and statistically significant factor in the selection of more suitable processing variables, besides temperature and steam. In the second step, a detailed study was performed for carotene thermal degradation in palm oil at four temperatures ranging from 170 ºC to 230 ºC. The heating process was carried out with injection of nitrogen and the samples were collected every 20 min during a total heating period of 140 min. The experimental data were then compared to literature data concerning carotenoids thermal degradation. The thermal degradation kinetics of carotenoids in palm oil followed an order superior to 1. In the next step of this work, response surface methodology (RSM) was applied to study the physical refining process of palm oil samples of different qualities, measured by their initial acidity. The influence of two operative conditions and a third quality parameter are considered: the temperature, the steam percentage, and the initial FFA. Their effect on the final FFA, tocols retention, neutral oil loss (NOL), and carotene retention was investigated. The results revealed that the initial FFA is a statistically important parameter to obtain acceptable values for final FFA, which has directly relation with the concentration of minor components in the oil by the submission to higher temperatures or longer refining periods, in order to reach the standard values. To end this work, it was evaluated the occurrence of hydrolysis of neutral oil during the steam deacidification. The results revealed that the highest percentages of FFA into the oil and the lowest percentages of FFA on the distillate were obtained when applying high steam flow rates associated with reduced stripping times. It was also observed that the generation of free fatty acids increases with the increasing of the percent of steam injected into the oil as well as with the increasing of the process temperature. The kinetic investigation revealed that the hydrolysis of neutral oil follows a first-order reactionMestradoCiência de AlimentosMestre em Ciência de Alimento