Investigation of the signal peptide and translocation system of Xanthomonas campestris β-lactamase

Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) 為十字花科蔬菜黑腐病菌，其分離株多可產生 β-lactamase (Bla)，以分解含 β-lactam ring 之抗生素。野生株 Xc11、Xc17 與 Xc85 的 bla 基因序列均已定序完成。依 signal peptide 序列推測 Xcc 可能利用 twin-arginine translocation (Tat) pathway 進行 Bla 之運送。本論文中首先構築了 Xc11 與 Xc17 的 tatA 與 tatC 基因突變株供探討。經以 Western blotting 測試，發現只有在 Xcc 野生株的胞質週緣區才能偵測到 Bla 的成熟蛋白，在tatA 與 tatC 突變株則否。 Xcc Tat 系統一旦被破壞，抗 β-lactam 抗生素的能力明顯減弱，MIC 值降低，顯示 Xcc Bla 的確藉由 Tat 系統運送。此外，經序列比對分析，發現 Bla 的第七個胺基酸 (Phe-7) 之變異會影響酵素產量。 Phe-7 為 signal peptide 的 Tat motif 中保守序列 Arg-Arg 下游的第二個胺基酸，在 Bacillus subtilis 該位置胺基酸具疏水性傾向。本論文中，將 Xcc Bla 蛋白的 Phe-7 突變為 Pro 、 Leu 、Arg 與 Tyr 後，其活性分別為原來的 5.3、24.5、47.5 及 107.1 %。在 Western blotting 結果中，所有突變株的 Bla 由細胞質運送至胞質週緣區的量皆減少。此外，突變為 Arg 後大量訊號胜肽未被切除的 pre-Bla 蛋白被發現累積在細胞質中。將 Phe-7 突變為親水性的Tyr-7 後，蛋白運送及訊號胜肽被辨識切除的效率稍微降低；而該位置突變為同屬疏水性胺基酸的 Leu 時，卻嚴重影響蛋白的運送與修飾。突變為 Pro-7，則可能因為訊號序列構形產生劇烈轉折，導致蛋白不穩定而容易被降解，是所有突變株中 Bla 表現最低者。上述研究結果顯示在不同物種中，Tat 系統辨識受質訊號序列之機制不盡相同，Xcc Bla 蛋白的 Phe-7 對於蛋白的運送及訊號胜肽的切除相當重要。此外，Xcc 野生株與 tatA、tatC 突變株在生長曲線、胞外多醣 (EPS) 的合成、運動能力以及 endoglucanase、protease、phospholipase C 等胞外酵素之表現上均無明顯差異，顯示影響這些性狀的蛋白主要並非經由 Tat系統進行分泌。然而，在 tatA 與 tatC 突變株的致病性測試中發現， tatA 突變株已無致病力，tatC 突變株則仍具致病性。由 RT-PCR的結果推測，tatA、tatB 與 tatC 屬同一個 operon。tatA 突變株之 tatA 無法被表現，tatB、tatC 表現量降低。 Tat 系統影響致病性的真正機制尚不清楚，有待繼續探討。縮寫字對照表 1 中文摘要 3 Abstract 4 前言 5 材料方法 11 I. 實驗材料 11 一、 菌種與質體 11 二、 藥品 11 三、 引子 (primer) 11 四、 試劑、緩衝溶液與培養基 11 II. 實驗方法 11 一、 質體 DNA 之抽取 11 二、 染色體 DNA 抽取 13 三、 洋菜膠體電泳分析 (Agarose gel electrophoresis) 13 四、 限制酶切割 14 五、 DNA 之回收 (Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit) 14 六、 DNA 黏接反應 (DNA ligation) 14 七、 大腸桿菌勝任細胞 (Competent cell) 製備 14 八、 大腸桿菌勝任細胞之轉形作用 (Transfromation) 15 九、 黃原菌電穿孔作用 (Electroporation) 15 十、 聚合酶鏈鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 16 十一、 質體快速篩選法 (Rapid screen) 16 十二、 菌體蛋白分離 16 十三、 蛋白濃度測定(Bio-rad Protein kit II) 17 十四、 蛋白質沉澱 17 十五、 SDS 聚丙醯胺凝膠蛋白質電泳分析 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE) 及染色 18 十六、 西方墨點法 (Western blot) 18 十七、 生長曲線測定 18 十八、 β-lactamase 活性試驗 19 十九、 最小抑制濃度試驗 (Minimal Inhibitory Concentration test, MIC) 20 二十、 胞外酵素分析 20 二十一、菌體 Motility 測試 21 二十二、胞外多醣 (extracellular polysaccharides, EPS) 測試 21 二十三、蛋白質二維電泳分析 21 二十四、蛋白質膠體銀染 23 二十五、致病性測試 23 二十六、反轉錄聚合酶連鎖反應 (reverse transcriptase-PCR ; RT-PCR) 23 結果與討論 25 一、 Xcc 之 Bla 蛋白以 Tat pathway 運送至胞質週緣區 25 1. Xc11與 Xc17 的 tatA、tatC 突變株之構築 25 2. 野生株與 tatA 、 tatC 突變株之 Bla 表現量的比較 26 二、 Bla 第七個胺基酸影響蛋白修飾與運送 28 1. 將 Bla N 端第七個胺基酸 Phe 突變為其他胺基酸 28 2. 以 Western blotting 與酵素活性分析法比較野生株與各定點突變株 Bla 蛋白之差異。 29 3. 以 Western blotting分析比較野生株與各定點突變株的胞質週緣區 (periplasm )與細胞質分層中 Bla 蛋白之表現。 30 4. 以 MIC test 比較野生株與定點突變株對於不同β-lactam類抗生素之抗性 31 三、 tat 基因突變對 Xcc 的生理、生化性質之影響 31 1. 測試 Xc11、Xc17野生株、tatA、tatC 突變株之生長曲線 32 2. 比較胞外酵素endoglucanase、protease 與 amylase 活性差異 32 3. 測試 Xc11、Xc17野生株、tatA、tatC 突變株之胞外多醣之差異 33 4. Xc11、Xc17野生株與 tatA、tatC 突變株 Motility 測試 34 5. 二維蛋白質電泳分析 Xc11 野生株與 TatC突變株之蛋白表現差異 34 四、 Xcc Tat pathway 與其致病性探討 35 1. 蛋白功能互補質體 pBBad22T-tatA、pBBad22T-tatC之構築 35 2. 測試 Xc17 野生株與 tatA、tatC 突變株致病性 36 3. RT-PCR 比較 Xc11、Xc17 野生株與 tatA 、tatC 突變株 mRNA 表現情形 36 4. Xcc Tat 系統如何影響致病性之關系尚不清楚 38 參考文獻 40 圖表. 47 附錄一 74 附錄二 75 附錄三 78 附錄四 8

Effective Multi-class Kernel MSE Classifier with Sherman-Woodbury Formula

線性分類方法大致上包含最小平方誤差法(Minimum Squared Error)和費雪線性區別(Fisher Linear Discriminant)。由於這兩種方法都是線性分類方法，為了能夠處理蘊含非線性特徵的實例(instance)，因此從最小平方誤差法衍生出以核心函數(kernel function)為根基的核心最小平方誤差法(Kernel Minimum Squared Error)，另外也從費雪線性區別衍生出以核心函數為根基的核心費雪區別(Kernel Fisher Discriminant)。這兩種方法都是把實例從原本的屬性空間(attribute space)投射到一個較高維度的特徵空間(feature space)裡，並在特徵空間裡使用線性分類方法。費雪線性區別和核心費雪區別的目的都是尋找一組方向使得訓練實例(training instances)投影在上面的區別分數(discriminant scores)可以提供最大的鑑別力來區分所有類別。然而，當資料包含大量的屬性或實例時，費雪線性區別和核心費雪區別將會很沒有效率。為了改善運算效能，我們用最小平方誤差法來處理線性分類問題。但在面對多類別的問題時，最小平方誤差法就會跟支持向量機器(Support Vector Machine)一樣，使用一對一(one-against-one)或一對多(one-against-the-rest)的方法。兩者都是無效率的方法，因為無法跟費雪線性區別和核心費雪區別一樣只用一個模型就可以處理多類別的問題。因此我們發展多類別最小平方誤差法(multi-class MSE)，使用雪曼-伍德布瑞(Sherman-Woodbury)公式來改善運算效能，並利用葛蘭-舒密特過程(Gram-Schmidt process)來決定類別標籤組合(class-labeling scheme)以處理多類別的問題。多類別最小平方誤差法的非線性應用稱作多類別核心最小平方誤差法(multi-class KMSE)。接著我們用一筆模擬的範例來描述這個方法的流程以及表現類別標籤組合的意義。最後我們用兩筆真實資料來對我們所提出的方法和傳統的分類方法進行比較。In general, there are two kinds of linear classification methods: one is MSE, and the other is FLD. Because linear methods are not sufficient to analyze the data with nonlinear patterns, the nonlinear methods KMSE and KFD are hence developed from MSE and FLD, respectively. Both transform the instances from the original attribute space to the high-dimensional feature space and then linear methods are applied. The objective of FLD and KFD is to find the directions on which the projection of training instances can provide the maximal separability of classes. FLD and KFD are known to be inefficient for datasets with a large amount of attributes and instances, respectively. To improve the computing efficiency, we use MSE for linear classification problems. However, MSE, like SVM, can use only the one-against-one or the one-against-the-rest approach to solve the multi-class problems. Both are inefficient compared to FLD and KFD where only one model is built to discriminate multiple classes simultaneously. Thus, we develop the multi-class MSE with Sherman-Woodbury formula to improve the computation efficiency. It can deal with multiple classes simultaneously by a class-labeling scheme. The different class-labeling schemes are determined by the Gram-Schmidt process. The nonlinear application, multi-class KMSE, is also developed from the multi-class MSE. Then, a simulated example is used to show how the proposed method works and to visualize the meaning of the class-labeling scheme. Finally, two real-world datasets are used for comparing the proposed method with other conventional methods.Abstract i 論文摘要 ii Contents iii Contents of Figures iv Contents of Tables v Chapter 1: Introduction 1 1.1 Background 1 1.2 Current Linear Approaches for Classification 2 1.2.1 Fisher Linear Discriminants 2 1.2.2 Minimum Squared Error Approach 4 1.3 Kernel Fisher Discriminants 7 1.4 Problems of Current Linear and Nonlinear Classification Approaches and Research Objectives 11 1.5 Thesis Organization 11 Chapter 2: Multi-Class Kernel MSE with Sherman-Woodbury Formula 13 2.1 Multi-class Minimum Squared Error Approach 13 2.2 Multi-class Kernel Minimum Squared Error Approach 20 2.3 Determination of the Optimal Class-Labeling Scheme 24 2.3.1 Gram-Schmidt Process 27 2.4 Sherman-Woodbury Formula 30 2.5 Illustration with a Simulated Example 31 Chapter 3: Case Study 38 3.1 Medline Text Dataset 38 3.2 Hayes-Roth Dataset 46 Chapter 4: Conclusions and Suggestions on Future Research 51 References 52 Appendix A: Principal Component Analysis 54 Appendix B: C# Code 5

On the Network Mobility Management Scheme with Seamless Handover

無線網路存取技術進步，開創行動網際網路的新時代，連帶車載通訊的需求也越來越高。然而車輛的高移動特性，突顯通訊裝置(device)本身電力與硬體的限制，從裝置到地面基地台這段無線線路品質因高速移動而低落。Network mobility是將全部一起移動的群體視為一個整體(entity)的概念，特別適合用來改善車載通訊的品質。在車輛行駛時，無可避免的需頻繁執行換手作業，所以需要有效率的換手協定，以符合即時通訊(real-time communications)的服務品質(QoS)要求。然而，車輛如是以高速移動，則用來完成換手程序的時限更短，再加上都卜勒效應會提高無線線路傳輸錯誤率，再再增加移動管理的難度。 在這篇論文中，我們首先研究面對高速行駛的車輛時，network mobility的移動管理協定之議題，並徹底檢視與比較各種network mobility解決方案的特點。基於使用彈性，路由效率和安全方面等原因，我們建議把車輛上的節點(nodes)根據他們自己的特點分成不同的網路，並用智能移動路由器(MRs)統一管理。 為了從通訊協定上支援高速行駛車輛的QoS-handover，我們提出在all-IP網路中，考量服務品質的network mobility架構和協議，稱之為Hi-NEMO，包含兩個互補的QoS-handover協定。Hi-NEMO不會在地面基地台(BS)與移動路由器(MR)間，增加額外的信令。模擬實驗顯示Hi-NEMO大幅降低在容易有傳輸錯誤的無線環境中的換手延遲(handover delay)。此外，有鑑於在這綠色科技的時代，高速鐵路系統日益流行，我們進一步研究以無線裝置連接到WiMAX的高速長途列車的移動管理。目前商業化設備產品中已設計了資源預留機制，以確保在換手過程中的QoS，不過仍有改進的空間。我們利用高速列車車長特性，提出2MR方案，於車上部署兩個移動路由器，並為在火車上的移動節點(mobile nodes)設計無縫換手協定。The evolution of wireless access technologies has led to a new era of mobile Internet for high speed vehicles. Network mobility is particularly suitable for vehicles because it considers the mobility of an entire network. Vehicles perform handover frequently thus efficient handover is essential to meet the QoS requirements for real-time communications. When moving with high speed, the time constraint is even stricter and the Doppler Effect increases the transmission error rate that both add challenges in mobility management. In this dissertation, we first study the mobility management protocols for network mobility and the issues when applying to high-speed vehicles. A thorough review and feature comparison of network mobility solutions are presented. For the reasons of flexibility, route efficiency and security concern, we suggest that the nodes in the vehicle to be separated into different networks based on their characteristics, and managed by smart mobile routers (MRs). To provide protocol-support for QoS-handover to high-speed vehicles, we propose a QoS incorporated network mobility architecture and protocols, called Hi-NEMO, for all-IP networks. Two complementary QoS-handover protocols are proposed, and Hi-NEMO does not introduce additional signaling between the BS and the MR. As a result, handover delay in an error-prone wireless environment can be reduced substantially. Furthermore, in the era of green technology, high-speed rail systems are increasingly popular. Therefore, we investigate the mobility provisioning for long distance high-speed trains in WiMAX. In practice, resource reservation mechanisms have been designed to ensure the QoS during handover; however, there are rooms for improvement. We take advantage of the long physical size of high-speed trains and proposed the 2MR scheme that deploys two MRs, and then design handover protocols to provide seamless handover for the mobile nodes on the train

Vertical Integration of L2/L3 Mobility Management Scheme for Hierarchical Mobile IPv6 Networks

網際網路（the Internet）的誕生與行動網際網路（Mobile Internet）的發展，在全球各地各界產生重大影響，需要大量頻寬且即時的應用程式相繼出現。Mobile IP讓使用者在網際網路上移動時保有原本的IP address，進而與其他主機進行通訊，提供使用者行動通訊的服務。IPv6是新一代的網際網路協定，它解決舊協定（IPv4）位址空間不足的問題，對位址空間有高需求的行動網際網路之發展，帶來相當大的助力。 行動通訊的使用環境大部分在於無線網路。當使用者在不同無線網路間移動會導致換手（Handoff）的發生，此一情形會觸發Mobil IP進行位址設定及重新註冊的動作，以將封包轉向新的無線網路中，使得使用者即使在移動至不同無線網路後仍能保有原來的通訊連線。但是Mobile IP在處理換手情形時會產生相當長的延遲（Latency），並且在這段延遲時間中更會發生封包遺失的現象。採用階層式的架構雖然可以減少Mobile IP重新註冊的延遲時間，但是對於如VoIP等即時的應用程式的使用順暢性仍嫌不足。 本論文設計了一套在階層式Mobile IPv6下之協定，用以縮短Mobile IPv6在處理換手情形時所產生的延遲，更可以大幅減少封包遺失的數量。 在靠使用者近端網路所建立的階層式節點（Foreign Mobility Agent, FMA），其末端節點（leaf-FMA）會透過Layer 2儀器如switch與無線網路接取點（Access Point, AP）連接。本論文所提出之新通訊協定在於，增加FMA與AP之互動，整合不同網路層對於行動主機（mobile node）移動所得到的資訊提早做出反應，轉送送給行動主機的封包，在減少換手延遲的同時更能大幅減少封包遺失的情形。 經過模擬結果驗證之後，可發現我們的新協定能在垂直整合下層無線技術的情況下，提供比階層式Mobile IP更佳的效能表現，在有效減少網路負載的同時，可使行動主機達到無間隙換手（Seamless Handoff）。The proposed Hierarchical Mobile IPv6 （HiMIPv6） extends the functionalities of Mobile IPv6 by introducing the hierarchically architecture. The routers in the foreign network are hierarchically structured, and the signaling overhead and latency of handoff are localized thus reduced. Using Vertical Integration of Layer 2/3 Mobility Management Scheme, the uncomfortableness when handoff occurred is further reduced. The movement of mobile node can be detected much earlier than using the original Mobile IPv6. The main idea is to reroute packets that destination is mobile node’s old care-of address to the new subnet which moble node moves in before binding update is been sent. The packet loss during handoff is dramatically reduced. The operation of HiMIPv6 and Vertical Integration of Layer 2/3 Mobility Management Scheme makes minimal impact on the original Mobile IPv6. Measurement of the prototype shows that it improves the quality of wireless connection effectively.論文摘要 四 THESIS ABSTRACT 五 目 錄 六 表 次 九 圖 次 一○ 第一章 緒論 1 第一節 背景 1 第二節 簡介 2 1.2.1. Handoff in Wireless Network 2 1.2.2. Mobile IP 4 1.2.3. Internet Protocol version 6（IPv6） 5 第三節 研究動機 6 第四節 研究目的 6 第二章 文獻探討 8 第一節 IETF MOBILE IPV6 8 2.1.1. Overview 8 2.1.2. Route Optimization 9 2.1.3. Comparison with Mobile IPv4 9 2.1.4. Mobile IP在handoff上的困境 11 第二節 INTEGRATION BETWEEN LAYERS 11 2.2.1. Fast Handover 12 2.2.2. Intellegent Handoff for Mobile Wireless Internet 14 第三節 HIERARCHICAL-CONSTRUCTED DOMAIN 15 2.3.1. Intra-Domain Handoff 15 2.3.2. Hierarchical Mobile IPv6 （HMIPv6） 16 第四節 INTER ACCESS POINT PROTOCOL 17 第三章 HIERARCHICAL MOBILE IPV6 （HIMIPV6） 20 第一節 HIMIPV6 SYSTEM ARCHITECTURE 20 第二節 SYSTEM FEATURES: FOREIGN MOBILITY AGENTS 22 3.2.1. Root-FMA 22 3.2.2. Leaf-FMA. 23 3.2.3. Functions of Foreign Mobility Agent 23 第三節 HIMIPV6實作細節 24 3.3.1. Visitor List. 24 3.3.2. Hierarchical Router Advertisement （Hy-RA） 25 3.3.3. Hierarchical Binding Update （Hy-BU） option 25 3.3.4. Receiver Home Address Option 26 3.3.5. Hy-Binding Inform （Hy-BI） option 26 第四節 HMIPV6與HIMIPV6之比較 27 第四章 系統架構 29 第一節 問題定義 29 4.1.1. Intra-subnet handoff 29 4.1.2. Inter-subnet handoff 30 第二節 問題分析 31 4.2.1. Intra-subnet handoff 31 4.2.2. Inter-subnet handoff 33 第三節 架構說明 34 4.3.1. 在同一L-FMA下的不同網域間移動 34 4.3.2. 在不同L-FMA下的不同網域間移動 37 4.3.3. Context Transfer 40 4.3.4. Using NewMNconfirm messages VS. Inside Hierarchy Multicast 41 第四節 VILM2S訊息欄位 43 4.4.1. MNinfoUpdate 43 4.4.2. NewMNconfirm 43 第五章 雛形系統實作設計 46 第一節 VMAC LIST 46 第二節 封包格式 49 5.2.1. MNinfoUpdate option 49 5.2.2. NewMNconfirm request option 50 5.2.3. NewMNconfirm reply option 52 第三節 訊息處理流程 54 5.3.1. ADD-notify 55 5.3.2. NewMNconfirm request 56 5.3.3. NewMNconfirm reply 56 5.3.4. Binding Update 57 5.3.5. MNinfoUpdate 58 第四節 IAPP FOR IPV6 59 第五節 動態設定ROUTING RULE 60 第六節 雛形系統架構 61 第六章 效能評估 63 第一節 測試情節描述 63 第二節 效能觀察 64 6.2.1. 未使用VILM2S 65 6.2.2. 使用VILM2S 67 6.2.3. 封包遺失情形比較 68 第七章 結論 71 參考文獻 7

食品機械廠物料管理及現場合理化-以伊立科技有限公司為例

[[abstract]]本組專題題目定為食品機械廠物料管理及現場合理化，研究對象是位於台中市是大里區的伊立科技有限公司。以品管手法的角度切入將其物料與現場合理化，並將問題數據化來做分析及進一步的探討，了解異常的發生且比對改善前後之差異，再以全面性思考將預防方法建立完整架構，以防止類似情形再度發生。 在此可以先從產品之原物料著手，觀察記錄並討論是否有異常發生，幫助上游公司將異常排除不僅能增進合作上的密切關係，更是讓貴公司提升品質及效能的方法之一，隨著製程的改善及進步，同時也提升公司產品的競爭力，創造更高的利益收入。 伊立科技有限公司為中小型企業，主要生產的產品為白灰定量機，且同時額外接白灰定量機的保養及故障維修，經過日前參訪會針對物料管理作核心，並搭現場合理化一起做探討，工廠內部空間並不大，若能善加利用空間不僅能創造更安全的移動空間，更能夠提減少部分多餘的浪費，再者為環境的維護，提供安全舒適的工作環境不僅能讓員工更有效率的工作也能減少不必要的工安意外發生。 本研究透過物料管理，藉由個案研究方法，利用全面生產管理的方式來探討，並針對工廠現地現物來做物料管理及現場合理化，強調改善後的對比

可處理並傳輸多媒體串流之開放式服務閘道器以及處理並傳輸多媒體串流之方法

[[abstract]]一種開放式服務閘道器,係可處理並傳輸多媒體串流,並且提供閘道器功能以支援開放式服務閘道器標準及通用隨插即用標準,該開放式服務閘道器包括:一開放式服務閘道器框架以及一開放式服務閘道器服務包;該開放式服務閘道器服務包包括一基本服務包功能區塊、一通用隨插即用服務包功能區塊以及一影音無限延伸服務包功能區塊;一種處理並傳輸多媒體串流之方法,該方法包括:取得使用者要求檔案;選擇適當的串流服務品質參數;將使用者要求檔案作即時轉碼,進而產生一多媒體串流;以及將該多媒體串流傳送至使用者端