11 research outputs found

    Алгоритм создания таргетных масс-спектрометрических методов для детекции белков

    Get PDF
    Determination of protein concentration in biological samples is an important task for biological research, as well as for medicine and routine clinical biochemistry. The introduction of stable isotope-labeled peptide standards (SIS) made it possible to determine accurately absolute protein concentrations in proteomic studies. The correct choice of SIS and the systematic way to develop a s method for selected reaction monitoring (SRM) are very important steps that are crucial for further identification and measurements of protein concentration. In this paper, we summarize our experience of selecting SIS for measuring the protein concentration by SRM. The results are presented in the form of an algorithm that describes the main stages of the SIS selection and the main points in the development of SRM methods for the targeted protein detection and determination of protein concentrations in biological samples.Определение концентраций белков является важной задачей в биологии и медицине, а также используется в клинической лабораторной практике для диагностики заболеваний. Измерения абсолютных концентраций белков в масс-спектрометрии стали возможны благодаря внедрению в практику внутренних стандартов, которые в точности соответствуют химической структуре измеряемого вещества, но синтезированы с использованием изотопно-меченых молекул. Правильный выбор внутреннего стандарта и систематических подход в разработке методики мониторинга выбранных реакций (Selected Reaction Monitoring, SRM) определяет качество идентификации и точность измерения концентрации таргетного белка. В данной работе суммирован наш опыт по выбору пептидного стандарта для измерения концентрации белков. Результаты представлены в виде алгоритма, который учитывает основные стадии выбора внутреннего стандарта и основные моменты разработки методов детекции и определения концентрации белко

    Сравнительный протеомный анализ изатин-связывающих белков печени и мозга мышей

    Get PDF
    Isatin (indol-2,3-dione) is an endogenous indole, exhibiting various biological activities that are realized via its interacts with numerous target proteins (so-called isatin-binding proteins). To date, isatin-binding proteins have been characterized in the brain of mice and rats. In this study we have performed a comparative proteomic analysis of the isatin-binding proteins of the mouse liver and brain. Proteomic profiling of clarified lysates of membrane and soluble fractions of liver and brain homogenates was performed using 5-aminocaproyl-isatin as an affinity ligand. During affinity based separation of isatin-binding proteins of soluble and membrane fractions of mouse brain homogenates lysed with Triton X-100, 63 individual proteins were identified. A similar separation of mouse liver homogenate fractions during affinity chromatography resulted in identification of 80 proteins. All identified liver and brain proteins belonged to the following functional groups: (I) Carbohydrate metabolism and energy generation; (II) Lipid metabolism; (III) Metabolism of nucleotides and amino acids; (IV) Formation of the cytoskeleton, exocytosis; (V) Regulation of gene expression, cell division and differentiation; (VI) Antioxidant and protective proteins; (VII) Signal transmission and regulation of enzyme activity. The total number of isatin-binding proteins common for the brain and liver was only 12. The most common for the brain and liver of isatin-binding proteins was found in group VI (antioxidant and protective proteins), complete absence of coincidence in group II (lipid metabolism) and group IV (formation of the cytoskeleton, exocytosis). The observed differences in the profile of isatin-binding proteins appear to play an important role in the specific effects of isatin in certain organs.Изатин (индол-2,3-дион) – эндогенный индол, проявляющий разнообразные виды биологической активности, которая реализуется при его взаимодействии с многочисленными белками-мишенями (т.н. изатин-связывающими белками). На сегодняшний день изатин-связывающие белки охарактеризованы в мозге мышей и крыс. Целью настоящего исследования был сравнительный протеомный анализ изатин-связывающих белков печени и мозга мышей. Протеомное профилирование осветленных лизатов мембранной и растворимой фракций гомогенатов печени и мозга выполнено с использованием 5-аминокапроилизатина в качестве аффинного лиганда. При аффинном разделении изатин-связывающих белков растворимых и мембранных фракций гомогенатов мозга мыши, лизированных тритоном Х-100, было идентифицировано 63 индивидуальных белка. Аналогичное разделение фракций гомогената печени мыши в ходе аффинной хроматографии позволило идентифицировать 80 белков. Все идентифицированные белки печени и мозга принадлежали к следующим функциональным группам: (I) Метаболизм углеводов и генерация энергии; (II) Метаболизм липидов; (III) Метаболизм нуклеотидов и аминокислот; (IV) Формирование цитоскелета, экзоцитоз; (V) Регуляция экспрессии генов, клеточного деления и дифференцировки; (VI) Антиоксидантные и протекторные белки; (VII) Передача сигнала и регуляция активности ферментов. При этом общее число изатин-связывающих белков, совпадающих для мозга и печени, было невелико - всего 12. Наибольшее число общих для мозга и печени изатин-связывающих белков обнаружено в группе VI (aнтиоксидантные и протекторные белки), полное отсутствие совпадений – в группе II (метаболизм липидов) и группе IV (формирование цитоскелета, экзоцитоз). Обнаруженные различия в профиле изатин-связывающих белков, по-видимому, играют важную роль в специфических эффектах изатина в определенных органах

    Алгоритм определения последовательности белка с использованием комбинации методов деградации по Эдману и панорамного масс спектрометрического анализа

    Get PDF
    An algorithm combining advantages of the Edman degradation method and de novo mass-spectrometric sequencing was developed. The protein from the “Diaskintest” diagnostic test was used for analysis. The protein was digested with trypsin and 5 steps of Edman degradation were carried out sequentially for the mixture of peptides. At each stage, the resulting mixture was analyzed by shotgun mass spectrometry analysis. The results of mass-spectrometry were analyzed both by the well-known de novo sequencing programs Novor and PepNovo+, and by own program that clustered individual spectra with a C-terminal signature formed by Y-ions. This approach allows us to determine confidently the amino acid sequence of the N-terminal part of the peptides obtained after the protein hydrolysis by trypsin.В работе рассмотрен алгоритм, позволяющий объединить преимущества таких методов как деградация по Эдману и масс-спектрометрическое de novo секвенирование. В качестве тестового белка в работе использовали белок-реагент для кожного теста “Диаскинтест”. Белок подвергали расщеплению трипсином и для смеси пептидов последовательно проводили 5 шагов деградации по Эдману. На каждом этапе полученную смесь подвергали протеомному панорамному анализу. Результаты анализировали как известными программами de novo секвенирования Novor и PepNovo+, так и собственной программой, кластеризующей отдельные спектры по C-концевой сигнатуре, образованной Y-ионами. Показано, что использование данного подхода позволяет уверено определить аминокислотную последовательность N-концевой части пептидов, полученных при гидролизе белка

    Оптимизация протокола получения экзосом и секретома клеток колоректальной аденокарциномы линии CACO-2 из кондиционированной среды для последующего масс-спектрометрического анализа

    Get PDF
    The conditioned media in which the tumor cells are cultured represents a model object for studying of secretome and proteomic composition of exosomes. This pool of proteins is of particular interest in terms of the search for potential markers of malignant diseases. The efficiency of the isolation of exosomes and secretome from the cell culture media largely determines the success of their analysis by the mass spectrometric method. In this paper, we have applied various approaches to isolate secretome and exosomes originated from Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells. The combination of ultrafiltration and centrifugation provided a deep proteomic analysis of the secretome and exosomes obtained from the one initial volume of conditioned medium without the addition of fetal bovine serum. Applying tandem mass spectrometric analysis we have identified 436 secreted proteins. In exosomes, the characteristic proteins ALIX, CD63, syntenin, lactadherin (MFGE8) were identified. Using targeted mass spectrometry, the exosome markers CD82, CD9 and HSPA8 were determined at the levels of 0.08 ± 0.03 fmol/μg, 0.13 ± 0.03 fmol/μg and 2.6 ± 0.02 fmol/μg of total protein, respectively. Among the secreted proteins, there were many markers associated with tumor progression and metastasis, such as DAG1, PODXL, LRRN4, TGFBI, IL6ST, DSC1, DSG1, and NPC2.Кондиционированная среда, в которой культивируют опухолевые клетки, служит модельным объектом для исследования секретома и протеомного состава экзосом. Данный пул белков представляет особый интерес с точки зрения поиска потенциальных маркеров злокачественных заболеваний. Эффективность выделения экзосом и секретома из среды культивирования клеток во многом определяет успешность их анализа масс-спектрометрическим методом. В данной работе мы применили различные подходы к выделению секретома и экзосом линии колоректальной аденокарциномы Caco-2. Сочетание ультрафильтрации и центрифугирования обеспечило глубокий протеомный анализ секретома и экзосом, полученных из одного начального объема кондиционированной среды без добавления фетальной бычьей сыворотки. Панорамный масс-спектрометрический анализ позволил идентифицировать 436 секретируемых белков. В экзосомах были идентифицированы характерные белки ALIX, СD63, синтенин, лактадгерин (MFGE8). С применением таргетной масс- спектрометрии были определены маркеры экзосом CD82, CD9 и HSPA8 на уровне 0.08±0.03 фмоль/мкг, 0.13±0.03 фмоль/мкг и 2.6±0.02 фмоль/мкг общего белка соответственно. Среди секретируемых белков оказалось множество маркеров, ассоциированных с опухолевой прогрессией и метастазированием, таких как DAG1, PODXL, LRRN4, TGFBI, IL6ST, DSC1, DSG1и NPC2

    Идентификация белков плазмы крови человека с использованием внутренних пептидных стандартов в панорамном протеомном анализе

    No full text
    LC-MS/MS allows identification of thousands of proteins in the complex proteomes. However, a significant part of a proteome remains inaccessible for identification due to the absence or poor quality of MS/MS spectra. The method described herein allows identifying the desired proteins of human blood plasma by comparing aligned chromatographic data of digested by trypsin sample and the same sample with spikedin synthetic peptides. Identification of human blood plasma proteins is archived by assigning tandem mass spectra of spiked-in peptides to the corresponding aligned chromatographic peaks of proteolytic peptides. Using the described approach we have identified 19 low abundant proteins in human blood plasma, which corresponded to 19 synthetic peptides used in the study. SRM verification of the identifications with isotopically labelled standards (SIS) confirmed the presence in the plasma of above 17 proteins.Использование метода панорамной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) позволяет идентифицировать в сложных протеомах до нескольких тысяч белков. Однако значительная часть протеома остается недоступной для идентификации из-за отсутствия или плохого качества МС/МС спектров. Описываемый в данной работе метод повышает вероятность идентификации белков плазмы крови человека путем выравнивания хроматографических данных образца смеси протеолитических пептидов и этого же образца, разбавленного синтетическими пептидами. Такая идентификация происходит в результате сопоставления тандемных масс-спектров синтетических пептидов с соответствующими выровненными хроматографическими пиками протеолитических пептидов. Используя данный подход, мы выявили 19 низко представленных белков плазмы крови человека, соответствующих 19 синтетическим пептидам, выбранным для исследования. Проверка идентификаций методом мониторинга диссоциативных переходов с изотопно-мечеными стандартами подтвердила наличие в плазме 17 белков

    Протеомный анализ ворсин хориона человека при анэмбрионии

    No full text
    In this study, the proteomic approach based on high performance liquid chromatography connected with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and bioinformatics analysis were applied to identify differentially abundant proteins in chorionic villus samples (CVS) from women with blighted ovum and normal pregnancy. We identified about 600 proteins in the solubilized fraction of CVS. Comparative proteomic analysis revealed differences in the content (Average Normalized Abundances) of 187 proteins in blighted ovum. These included 134 down-regulated proteins and 53 up-regulated proteins. According to bioinformatics analysis these proteins participate in a variety of metabolic processes, including alcohol and tricarboxylic acid metabolism, response to endoplasmic reticulum stress, small molecular catabolic process, cellular respiration, and others. Proteins that demonstrated growing content in blighted ovum were mainly encoded by genes located on chromosomes 7 and 16 whereas proteins which demonstrated reducing abundance were mainly encoded by genes located on chromosomes 1, 2, and 11. We also revealed changes in the content of proteins encoded by genes located on the human chromosome 18; they are involved in apoptotic and drug metabolic processes with an important role in early pregnancy loss. Our pilot results demonstrate the efficiency of the LC-MS/MS approach for detecting the differences at the qualitative and semi-quantitative levels in the protein profiles of the CVS at anembryonic pregnancy compared to normal gestation. We conclude that globally profiled and differentially regulated proteins of CVS are helpful in obtaining molecular insights into biological processes of the pregnancy pathology.В данной работе протеомный подход, основанный на жидкостной хроматографии, совмещенной с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS), и биоинформатический анализ были применены для выявления различий между белковым профилем ворсин хориона человека при анэмбриональной беременности по сравнению с нормальной. Всего в солюбилизированной фракции хориона было идентифицировано около 600 белков. Сравнительный протеомный анализ с использованием программного обеспечения Progenesis LS-MS показал изменение содержания 187 белков при анэмбрионии, из них 134 белка продемонстрировали снижение и 53 белка – повышение концентрации (average normalized abundances). Биоинформатический анализ свидетельствует, что эти белки принимают участие в различных метаболических процессах, включая метаболизм алкоголя и трикарбоновых кислот, в реакциях, ассоциируемых со стрессом эндоплазматического ретикулума, процессах катаболизма, клеточном дыхании и других. Кроме того, зарегистрировано изменение содержания белков, кодируемых хромосомой 18 человека, принимающих участие в апоптозе и реакциях метаболизма лекарственных средств, а также процессах, играющих важную роль при потерях в ранние сроки беременности. Наши предварительные результаты демонстрируют эффективность LC-MS/MS для выявления качественных и полуколичественных различий белкового профиля ворсин хориона при анэмбриональной беременности по сравнению с нормальной. Сделан вывод о том, что широкомасштабное профилирование дифференциально регулируемых белков ворсин хориона может быть полезно для понимания биологических процессов, протекающих при патологии беременности

    Regulation of Proteins in Human Skeletal Muscle: The Role of Transcription

    No full text
    © 2020, The Author(s). Regular low intensity aerobic exercise (aerobic training) provides effective protection against various metabolic disorders. Here, the roles played by transient transcriptome responses to acute exercise and by changes in baseline gene expression during up-regulation of protein content in human skeletal muscle were investigated after 2 months of aerobic training. Seven untrained males were involved in a 2 month aerobic cycling training program. Mass-spectrometry and RNA sequencing were used to evaluate proteome and transcriptome responses to training and acute exercise. We found that proteins with different functions are regulated differently at the transcriptional level; for example, a training-induced increase in the content of extracellular matrix-related proteins is regulated at the transcriptional level, while an increase in the content of mitochondrial proteins is not. An increase in the skeletal muscle content of several proteins (including mitochondrial proteins) was associated with increased protein stability, which is related to a chaperone-dependent mechanism and/or reduced regulation by proteolysis. These findings increase our understanding of the molecular mechanisms underlying regulation of protein expression in human skeletal muscle subjected to repeated stress (long term aerobic training) and may provide an opportunity to control the expression of specific proteins (e.g., extracellular matrix-related proteins, mitochondrial proteins) through physiological and/or pharmacological approaches

    Гены «стахановцы» 18 хромосомы человека, отсутствующие белки и не охарактеризованные белки в ткани печени и клеточной линии HepG2

    No full text
    Missing (MP) and functionally uncharacterized proteins (uPE1) comprise less than 5% of the total number of proteins encoded by human Chr18 genes. Within half a year, since the January 2020 version of NextProt, the number of entries in the MP+uPE1 datasets changed, mainly due to the achievements of antibody-based proteomics. Assuming that the proteome is closely related to the transcriptome scaffold, quantitative PCR, Illumina HiSeq, and Oxford Nanopore Technology were applied to characterize the liver samples of three male donors in comparison with the HepG2 cell line. The data mining of the Expression Atlas (EMBL-EBI) and the profiling of biopsy samples by using orthogonal methods of transcriptome analysis have shown that in HepG2 cells and the liver, the genes encoding functionally uncharacterized proteins (uPE1) are expressed as low as for the missing proteins (less than 1 copy per cell), except the selected cases of HSBP1L1, TMEM241, C18orf21, and KLHL14. The initial expectation that uPE1 genes might be expressed at higher levels than MP genes, was compromised by severe discrepancies in our semi-quantitative gene expression data and in public databanks. Such discrepancy forced us to revisit the transcriptome of Chr18, the target of the Russian C-HPP Consortium. Tanglegram of highly expressed genes and further correlation analysis have shown the severe dependencies on the mRNA extraction method and the analytical platform. Targeted gene expression analysis by quantitative PCR (qPCR) and high-throughput transcriptome profiling (Illumina HiSeq and ONT MinION) for the same set of samples from normal liver tissue and HepG2 cells revealed the detectable expression of 250+ (92%) protein-coding genes of Chr18 (at least one method). The expression of slightly more than 50% protein-coding genes was detected simultaneously by all three methods. Correlation analysis of the gene expression profiles showed that the grouping of the datasets depended almost equally on both the type of biological material and the experimental method, particularly cDNA/mRNA isolation and library preparation.Отсутствующие белки и функционально не охарактеризованные белки (в англоязычной литературе обозначенные как missing (MP) и functionally uncharacterized proteins (uPE1), соответственно) составляют менее 5% от общего числа белков, кодируемых генами 18 хромосомы человека. В течение полугода, начиная с января 2020 года, в версии NextProt выросло количество записей в наборах данных MP+uPE1. Подобные изменения обусловлены преимущественно достижениями протеомики на основе антител. В данной работе количественная ПЦР, технологии секвенирования Illumina HiSeq и Oxford Nanopore Technologies были применены для сравнительного анализа транскриптомного профиля образцов печени трех доноров мужского пола и клеточной линии HepG2. Анализ данных атласа экспрессии (Expression Atlas, EMBL-EBI) и полученных результатов по биологическим образцам с использованием ортогональных методов анализа транскриптома показал, что в клетках печени и HepG2 уровень экспрессии генов, кодирующих функционально не охарактеризованные белки (uPE1), находится на таком же низком уровне, как и в случае генов MP (в количестве менее 1 копии на клетку). Исключение составили несколько генов: HSBP1L1, TMEM241, C18orf21 и KLHL14. Согласно существенным расхождениям в ранее полученных полуколичественных данных по экспрессии генов и данным в открытых базах данных, изначально предполагалось, что экспрессия генов uPE1 может быть выше, чем генов MP. Подобное расхождение побудило обратиться к транскриптому 18 хромосомы человека, являющейся целевой для России в проекте «Протеом человека». Полученные результаты о наиболее экспрессируемых генах и дальнейший корреляционный анализ показал существование зависимости от метода экстракции мРНК и аналитической платформы. Анализ экспрессии целевых генов 18 хромосомы с применением количественной ПЦР (qPCR) и методов высокопроизводительного профилирования транскриптома (Illumina HiSeq и ONT MinION) для одинаковых наборов образцов нормальной ткани печени и клеточной линии HepG2 выявил более 250 (92%) белок-кодирующих генов, детектируемых хотя бы одним методом. Экспрессия более чем 50% белок-кодирующих генов была детектирована всеми тремя методами. Корреляционный анализ профилей экспрессии генов показал, что результаты «группируются» в зависимости от типа биологического материала и экспериментальных методов, в частности от способа подготовки библиотеки (выделения кДНК, мРНК). Зависимость от выбора способа биоинформатической обработки была отмечена в значительно меньшей степени
    corecore