13 research outputs found

    Особенности пробоподготовки лизатов для повышения эффективности выделения белковых партнеров целевых белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека

    Get PDF
    The aim of this work was to test modifications of the standard protocol for the sample preparation of cell/tissue lysate before performing the affinity isolation of lysate protein partners for the target protein (bait protein) which is covalently immobilized on an inert sorbent (e.g. BrCN-, SH-Sepharose 4B) or a carrier (e.g. paramagnetic nanoparticles). The series of our previous works on applying the approach to direct molecular fishing procedure with combination of affinity chromatography and LC-MS/MS analysis using a number of proteins, encoded by the genes of human chromosome 18, have shown that there are at least two problems affecting the specificity and the effectiveness of this procedure. These include: (i) redundancy of the background proteins in the eluates from an affinity sorbent (carrier) due to isolation of multiprotein complexes “labeled” with a direct protein partner which binds with a bait protein immobilized on the sorbent; (ii) low enrichment of the eluates with appropriate protein partners due to the fact that some direct protein partners in the lysate exist in stable “wild type” complexes with the bait protein itself. This means that latter group of protein partners will not be sufficiently isolated from lysate. Therefore, in order to increase the specificity and efficiency of affinity isolation of protein partners for the bait protein, we modified the standard protocol of lysate preparation and the preliminary step on dissociation of lysate protein complexes was added. Several model experiments for the choice of regeneration solution, assessment of their efficiency in the dissociation of lysate protein complexes as well as the stability and binding capacity of proteins were performed under the control of surface plasmon resonance (SPR) biosensor Biacore 3000 using HepG2 cell lysate. It was shown that acid treatment and incubation of the cell lysate for one min on ice (final lysate dilution 20 times) and subsequent neutralization (pH shift from 2.0 to 7.4) resulted in maximal dissociation of the lysate protein complexes without significant negative effects on the protein-protein interactions tested.Целью работы было экспериментальное тестирование модификации стандартного протокола пробоподготовки клеточного/ тканевого лизата перед выполнением процедуры аффинного выделения из него белков-партнеров для целевого белка (белка-наживки), иммобилизованного на инертном сорбенте или парамагнитных наночастицах. Цикл наших предыдущих работ, посвященных прямому молекулярному фишингу с сопряжением хроматографических и масс-спектрометрических методов и технологии парамагнитных наночастиц c использованием ряда белков 18-ой хромосомы человека и также других белков показал, что существуют, по крайне мере, две проблемы, влияющие на специфичность и эффективность данной процедуры: (i) избыточность фоновых белков в элюатах с аффинного сорбента, обусловленная выделением мультибелковых комплексов, меченых прямым партнером, который связывается с целевым белком на сорбенте; (ii) низкая обогащенность элюатов белками-партнерами целевой группы обусловленная тем, что та или иная часть прямых белков-партнеров в лизате находится в составе стабильных комплексов «дикого типа» с самим белком-наживкой и не будет в достаточной степени выделена из лизата. Поэтому для повышения специфичности и эффективности аффинного выделения белков-партнеров целевого белка нами предложена модификация стандартной пробоподготовки, заключающаяся в предварительной диссоциации белковых комплексов лизата. Модельные эксперименты по выбору регенерационного раствора, оценке стабильности и связывающей способности белков при его воздействии, а также оценка эффективности диссоциации комплексов в лизате были выполнены под контролем оптического биосенсора Biacore 3000 («GE Healthcare», США) с использованием лизата клеточной культуры гепатокарциномы человека (HepG2) и рекомбинантных препаратов белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека, Показано, что кислотная обработка разбавленного в 20 раз лизата с кратковременной экспозицией в течение 1 мин на льду и с последующей нейтрализацией (с рН 2.0 до рН 7.4) приводила к максимальной диссоциации белковых комплексов лизата, не оказывая существенного негативного влияния на тестируемые белок- белковые взаимодействия

    Идентификация рибосомных футпринтов на электрофоретическом геле при профилировании транслатома: использование ДНК-маркёров

    No full text
    The commercial DNA ladder was tested as a substitute for RNA size standards to identify ribosomal footprints (RNA fragments of about 30 nucleotides long) on an electrophoretic polyacrylamide gel for the purposes of translatome profiling. It has been found that 25 and 35 nucleotides long synthetic RNA oligonucleotides do migrate slower than the synthetic DNA oligonucleotides of the matching length and sequences and their positions on the gel coincide with those of 30 and 40 nucleotides long DNA oligonucleotides, correspondingly, of the commercial IDT 20/100 DNA oligo length standards. By using this DNA ladder and RNA isolated from the preparation enriched in ribosomes (obtained by fractionating on MicroSpin S-400 columns the HepG2 cell lysate treated with RNase I), the position of a band of putative ribosomal footprints can be identified on a gel that has been verified by measuring in an RNA-seq experiment the length of RNA fragments extracted from the band.Коммерческие ДНК-маркёры тестировали как замену РНК-стандартов длины молекулы для идентификации рибосомных футпринтов (фрагментов РНК длиной около 30 нуклеотидов) на электрофоретическом полиакриламидном геле при профилировании транслатома. Было обнаружено, что синтетические РНК-олигонуклеотиды длиной 25 и 35 нуклеотидов мигрируют медленнее, чем синтетические ДНК-олигонуклеотиды соответствующей длины и последовательностей, и их положение на геле совпадает с положением ДНК- олигонуклеотидов длиной 30 и 40 нуклеотидов соответственно из коммерческого набора стандартов длин ДНК-олигонуклеотидов «IDT 20/100 DNA oligo length standards». Используя данный набор и РНК, выделенную из препарата, обогащенного рибосомами (полученного фракционированием на колонках MicroSpin S-400 клеточного лизата HepG2, обработанного РНКазой I), можно идентифицировать положение полосы предполагаемых рибосомных футпринтов на геле, что было подтверждено измерением длины фрагментов РНК, выделенных из полосы, при проведении их секвенирования методом RNA-seq

    Osteogenic potential of multipotent mesenchymal stromal cells from human exfoliated deciduous teeth before and after cryopreservation

    No full text
    The use of multipotent mesenchymal stromal cellsfrom human exfoliated deciduous teeth (SHED) to stimulate bone regeneration requires data on the influence of cryopreservation on the osteogenic differentiation capacity of these cells. SHED were subjected to cryopreservation. Before freezing and after thawing, cell cultures were exposed osteogenic differentiation with vitamin D3 or dexametasone and assessed for expression of the osteogenic markers osteocalcin, alkaline phosphatase, BMP-2 and RunX2 using real-Time qPCR. Extracellular matrix (ECM) mineralization was evaluated by Alizarin red staining. Supplementation of osteogenic medium with vitamin D3 increased the expression of the osteogenic markers osteocalcin, alkaline phosphatase, BMP-2 and RunX2 as well as promoted an increase in the synthesis and mineralization of ECM in the cells both before and after cryopreservation. In the presence of vitamin D3 gene expression of alkaline phosphatase, BMP-2 and RunX2 after cryopreservation was higher than before freezing. Gene expression of osteocalcin, BMP2 RunX2 in osteogenic medium with vitamin D3was higher compared with dexamethasone for 14 days differentiation both before or after cryopreservation. The maintenance of SHED osteogenic differentiation potential after long-Term cryopreservation provides a basis for banking of these cellsfor further auto- or allotransplantation

    Osteogenic potential of multipotent mesenchymal stromal cells from human exfoliated deciduous teeth before and after cryopreservation

    No full text
    The use of multipotent mesenchymal stromal cellsfrom human exfoliated deciduous teeth (SHED) to stimulate bone regeneration requires data on the influence of cryopreservation on the osteogenic differentiation capacity of these cells. SHED were subjected to cryopreservation. Before freezing and after thawing, cell cultures were exposed osteogenic differentiation with vitamin D3 or dexametasone and assessed for expression of the osteogenic markers osteocalcin, alkaline phosphatase, BMP-2 and RunX2 using real-Time qPCR. Extracellular matrix (ECM) mineralization was evaluated by Alizarin red staining. Supplementation of osteogenic medium with vitamin D3 increased the expression of the osteogenic markers osteocalcin, alkaline phosphatase, BMP-2 and RunX2 as well as promoted an increase in the synthesis and mineralization of ECM in the cells both before and after cryopreservation. In the presence of vitamin D3 gene expression of alkaline phosphatase, BMP-2 and RunX2 after cryopreservation was higher than before freezing. Gene expression of osteocalcin, BMP2 RunX2 in osteogenic medium with vitamin D3was higher compared with dexamethasone for 14 days differentiation both before or after cryopreservation. The maintenance of SHED osteogenic differentiation potential after long-Term cryopreservation provides a basis for banking of these cellsfor further auto- or allotransplantation

    Neutron powder diffraction and single crystal X ray magnetic resonant and non resonant scattering studies of the doped multiferroic Tb Bi MnO3

    No full text
    The results of powder neutron diffraction, X ray resonant and non resonant scattering in Tb0.95Bi0.05MnO3 demonstrate that substitution of Bi for Tb leads to partial suppression of intrinsic long range magnetic order in the Tb sub lattice, which transforms to correlated short range order. The magnetic order in the Mn sub lattice remains similar to that of TbMnO3. In the Bi substituted sample an anomaly in the temperature dependencies of the unit cell parameters was detected at about 100

    Determination of taper parameters of first intermediate rolls of 20-roll 400 (sendzimir) mill

    No full text
    22.00; Translated from Russian (Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved., Chern. Metall. 1986 (7) p. 72-75)SIGLEAvailable from British Library Document Supply Centre- DSC:9022.06(BISI--25375)T / BLDSC - British Library Document Supply CentreGBUnited Kingdo

    Гены «стахановцы» 18 хромосомы человека, отсутствующие белки и не охарактеризованные белки в ткани печени и клеточной линии HepG2

    No full text
    Missing (MP) and functionally uncharacterized proteins (uPE1) comprise less than 5% of the total number of proteins encoded by human Chr18 genes. Within half a year, since the January 2020 version of NextProt, the number of entries in the MP+uPE1 datasets changed, mainly due to the achievements of antibody-based proteomics. Assuming that the proteome is closely related to the transcriptome scaffold, quantitative PCR, Illumina HiSeq, and Oxford Nanopore Technology were applied to characterize the liver samples of three male donors in comparison with the HepG2 cell line. The data mining of the Expression Atlas (EMBL-EBI) and the profiling of biopsy samples by using orthogonal methods of transcriptome analysis have shown that in HepG2 cells and the liver, the genes encoding functionally uncharacterized proteins (uPE1) are expressed as low as for the missing proteins (less than 1 copy per cell), except the selected cases of HSBP1L1, TMEM241, C18orf21, and KLHL14. The initial expectation that uPE1 genes might be expressed at higher levels than MP genes, was compromised by severe discrepancies in our semi-quantitative gene expression data and in public databanks. Such discrepancy forced us to revisit the transcriptome of Chr18, the target of the Russian C-HPP Consortium. Tanglegram of highly expressed genes and further correlation analysis have shown the severe dependencies on the mRNA extraction method and the analytical platform. Targeted gene expression analysis by quantitative PCR (qPCR) and high-throughput transcriptome profiling (Illumina HiSeq and ONT MinION) for the same set of samples from normal liver tissue and HepG2 cells revealed the detectable expression of 250+ (92%) protein-coding genes of Chr18 (at least one method). The expression of slightly more than 50% protein-coding genes was detected simultaneously by all three methods. Correlation analysis of the gene expression profiles showed that the grouping of the datasets depended almost equally on both the type of biological material and the experimental method, particularly cDNA/mRNA isolation and library preparation.Отсутствующие белки и функционально не охарактеризованные белки (в англоязычной литературе обозначенные как missing (MP) и functionally uncharacterized proteins (uPE1), соответственно) составляют менее 5% от общего числа белков, кодируемых генами 18 хромосомы человека. В течение полугода, начиная с января 2020 года, в версии NextProt выросло количество записей в наборах данных MP+uPE1. Подобные изменения обусловлены преимущественно достижениями протеомики на основе антител. В данной работе количественная ПЦР, технологии секвенирования Illumina HiSeq и Oxford Nanopore Technologies были применены для сравнительного анализа транскриптомного профиля образцов печени трех доноров мужского пола и клеточной линии HepG2. Анализ данных атласа экспрессии (Expression Atlas, EMBL-EBI) и полученных результатов по биологическим образцам с использованием ортогональных методов анализа транскриптома показал, что в клетках печени и HepG2 уровень экспрессии генов, кодирующих функционально не охарактеризованные белки (uPE1), находится на таком же низком уровне, как и в случае генов MP (в количестве менее 1 копии на клетку). Исключение составили несколько генов: HSBP1L1, TMEM241, C18orf21 и KLHL14. Согласно существенным расхождениям в ранее полученных полуколичественных данных по экспрессии генов и данным в открытых базах данных, изначально предполагалось, что экспрессия генов uPE1 может быть выше, чем генов MP. Подобное расхождение побудило обратиться к транскриптому 18 хромосомы человека, являющейся целевой для России в проекте «Протеом человека». Полученные результаты о наиболее экспрессируемых генах и дальнейший корреляционный анализ показал существование зависимости от метода экстракции мРНК и аналитической платформы. Анализ экспрессии целевых генов 18 хромосомы с применением количественной ПЦР (qPCR) и методов высокопроизводительного профилирования транскриптома (Illumina HiSeq и ONT MinION) для одинаковых наборов образцов нормальной ткани печени и клеточной линии HepG2 выявил более 250 (92%) белок-кодирующих генов, детектируемых хотя бы одним методом. Экспрессия более чем 50% белок-кодирующих генов была детектирована всеми тремя методами. Корреляционный анализ профилей экспрессии генов показал, что результаты «группируются» в зависимости от типа биологического материала и экспериментальных методов, в частности от способа подготовки библиотеки (выделения кДНК, мРНК). Зависимость от выбора способа биоинформатической обработки была отмечена в значительно меньшей степени
    corecore