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    Novel functionalized and patterned surfaces for cardiovascular applications

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    Nowadays, cardiovascular diseases are mainly treated by implantation of a metallic or polymeric mesh, called stent, which maintains the artery widely open. This technique shows very good clinical results, however, it exists non-negligible cases of in-stent restenosis (ISR) and late stent thrombosis (LST) during the first year after stent implantation. These complications are mainly due to a delayed recovery of the endothelium after stent implantation, which also involves smooth muscle cells (SMCs) over-proliferation and platelets aggregation. Stent surface modification to modulate a specific cell lineage response has not been comprehensively explored. In particular, surface nano-topography, biofunctionalization or chemical features may be applied to increase endothelial cells (ECs) adhesion and/or migration, and to control platelet agglomeration. The overall aim of this thesis was to obtain novel modified surfaces for stents implants with the ability to induce accelerated reendothelialization and controlled platelet aggregation in order to avoid ISR and LST. On CoCr alloy, as the gold standard material for bare metal stents (BMSs), two different strategies were evaluated, generation of linear patterns by direct laser interference patterning (DLIP) and, immobilization of biomolecules. On poly(L-lactic acid) (PLLA), as a material for bioresorbable stents (BRSs), endothelialization was enhanced by surface functionalization with NaOH etching, plasma treatment and cutinase enzyme hydrolysis. CoCr alloy surfaces were successfully modified with a linear pattern of different periodicities and depths. Afterwards, Arg-Gly-Asp (RGD) and Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) peptides were covalently immobilized to the surfaces through silanization. Early ECs adhesion was improved on the peptide-functionalized surfaces, especially for YIGSR compared to RGD. High-depth nano-patterned surfaces generated ECs alignment within the topographical lines and enhanced ECs migration. Noteworthy, the combined use of both strategies, topography and biofunctionalization, synergistically accelerated the ECs migration and proliferation. Also, platelet adhesion and aggregation decreased in all patterned surfaces compared to smooth CoCr XI probably due to changes in wettability and oxide layer characteristics. Cellular studies provided evidence of the potential of DLIP topographies and YIGSR biofunctionalization to foster endothelialization without enhancement of platelet adhesion, which will be of high importance when designing new stents. Concerning polymeric biodegradable materials, PLLA films were obtained by solvent-casting in chloroform and, oxygen plasma, NaOH solution or cutinase enzyme treatments were used to functionalize the PLLA films and create surface hydroxyl and carboxyl groups without compromising biocompatibility. A higher amount of functional groups and an improved ECs adhesion was observed by oxygen plasma and cutinase enzyme hydrolysis compared to NaOH etching. Plasma or cutinase enzyme functionalized PLLA films presented a degradation rate similar to a peripheral commercial stent. Finally, 3D-printed PLLA BRSs were obtained by solvent-cast direct write technique. Consequently, the combined use of the solvent-cast direct write technique and plasma or enzyme functionalization holds a great potential to fabricate 3D-printed PLLA BRSs with the capacity to accelerate the surface endothelialization. Overall, the present thesis offers a comprehensive view of the effectiveness of modifying CoCr alloys and PLLA films with specific topographies or functionalization strategies to enhance surface endothelialization while preventing restenosis and thrombosis.Heutzutage werden vaskul√§re Erkrankungen haupts√§chlich durch Implantation eines metallischen oder polymeren Netzes, genannt Stent, behandelt, welcher vormals verengte Arterien weit ge√∂ffnet h√§lt. Diese Technik zeigt bereits sehr gute klinische Ergebnisse. Allerdings existieren auch nicht zu vernachl√§ssigende F√§lle von In-Stent Restenose (ISR) und sp√§ten Stentthrombosen (LST) im ersten Jahr nach Implantation des Stents. Diese Komplikationen entstehen haupts√§chlich aufgrund einer verz√∂gerten Erholung der Endothele nach Einsetzen des Stents, sowie durch √ľberm√§√üiges Wachstums der vaskul√§ren glatten Muskelzellen (SMCs) und einer Thrombozytenaggregation. Modifikationen der Stent-Oberfl√§che, um die Interaktion mit spezifischen Zellypen zu kontrollieren, sind noch nicht umfassend erforscht. Insbesondere k√∂nnen Oberfl√§chen-Nano-Topographie, Biofunktionalisierung oder chemische Modifizierungen angewendet werden, um die Adh√§sion und / oder Migration der Endothelzellen (ECs) zu erh√∂hen und die Agglomeration von Blutpl√§ttchen niedrig zu halten. Das Gesamtziel dieser Arbeit war es, neuartige modifizierte Oberfl√§chen f√ľr Stentimplantate zu entwickeln, die die Reendothelialisierung beschleunigen und eine Thrombozytenaggregation verringern, um ISR und LST vorzubeugen. Auf einer CoCr-Legierung, dem Gold-Standard-Material f√ľr unbeschichtete Metallstents (BMSs), wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt; einerseits die Erzeugung linearer Muster durch direkte Laserinterferenzstrukturierung (DLIP) und Immobilisierung von Biomolek√ľlen. Auf Poly (L-Milchs√§ure) (PLLA) als Material f√ľr bioresorbierbare Stents (BRSs) wurde die Endothelialisierung durch Oberfl√§chenfunktionalisierung mit NaOH-√Ątzen, mit einer Plasmabehandlung und mit Cutinase-Enzym-Hydrolyse verbessert. Zum anderen wurden Oberfl√§chen einer CoCr-Legierung erfolgreich mit einem Linien-Muster unterschiedlicher Periodizit√§t und Tiefe modifiziert. Anschlie√üend wurden Arg-Gly-Asp (RGD) und Tyr-lle-Gly-Ser-Arg (YIGSR) Peptide durch Silanisierung kovalent an den Oberfl√§chen immobilisiert. Die fr√ľhe ECs-Adh√§sion wurde auf den Peptid-funktionalisierten Oberfl√§chen verbessert, insbesondere XIII f√ľr YIGSR im Vergleich zu RGD. Nanostrukturierte Oberfl√§chen mit gro√üer Tiefe erzeugten eine ECs-Ausrichtung innerhalb der topographischen Linien und f√∂rderten die EC-Migration und -Proliferation. Bemerkenswerterweise wurden diese synergetisch durch Kombination der zwei Strategien, Topographie und Biofunktionalisierung, beschleunigt. Auch die Thrombozytenadh√§sion und ‚Äďaggregation sanken in allen strukturierten Oberfl√§chen verglichen mit glattem CoCr, m√∂glicherweise auf Grund von Ver√§nderungen der Benetzbarkeit und der Oxidschichteigenschaften. Zellstudien belegen das Potential von DLIP-Topographien und YIGSR-Biofunktionalisierung, um die Endothelialisierung ohne Erh√∂hung der Thrombozytenadh√§sion zu f√∂rdern, was von gro√üer Bedeutung bei der Entwicklung neuer Stents sein wird. In Bezug auf polymere biologisch abbaubaren Materialien wurden PLLA-Schichten durch Solvent-Casting in Chloroform hergestellt. Sauerstoffplasma, NaOh-L√∂semittel oder Cutinase-Enzym-Behandlungen wurden genutzt, um die PLLA-Schichten zu funktionalisieren und Oberfl√§chen-Hydroxylgruppen und -Carboxylgruppen herzustellen, ohne die Biokompatibilit√§t zu beeintr√§chtigen. Im Vergleich zu NaOH-√Ątzen wurden durch Sauerstoffplasma und durch Cutinase-Enzym-Hydrolyse eine h√∂here Anzahl an funktionellen Gruppen und eine verbesserte ECs-Adh√§sion festgestellt. Plasma- oder Cutinase-Enzym-funktionalisierte PLLA-Schichten zeigten eine √§hnliche Degradation wie ein peripher, kommerzieller Stent. Abschlie√üend wurden 3D-gedruckte PLLA-BRSs durch Solvent-Cast Direct Writing hergestellt. Folglich bietet die Kombination aus Solvent-Cast Direct Writing und Plasma- oder Enzymfunktionalisierung ein gro√ües Potenzial, 3D-gedruckte PLLA-BRSs mit beschleunigter Oberfl√§chenendothelialisierung herzustellen. Insgesamt bietet die vorliegende Arbeit einen umfassenden √úberblick √ľber die Effektivit√§t der Modifizierung von CoCr-Legierung und PLLA-Filmen mit spezifischen Topographien oder Funktionalisierungsstrategien zur Verbesserung der Oberfl√§chenendothelialisierung bei gleichzeitiger Vermeidung von Restenose und Thrombose.Actualmente las enfermedades cardiovasculares est√°n principalmente tratadas por implantaci√≥n de una malla met√°lica o polim√©rica, llamada stent, que mantiene la arteria abierta. Esta t√©cnica presenta muy buenos resultados cl√≠nicos, sin embargo, existen casos de reestenosis intra-stent (ISR) y trombosis tardia del stent (LST) durante el a√Īo que sigue la implantaci√≥n. Estas complicaciones est√°n principalmente debidas a una reparaci√≥n demasiado lenta del endotelio despu√©s de la implantaci√≥n del stent; que tambi√©n implica una sobre-proliferaci√≥n de c√©lulas musculares lisas y una agregaci√≥n de plaquetas. La modificaci√≥n de la superficie del stent para generar una respuesta celular espec√≠fica no ha sido explorada en profundidad. Particularmente, nano-topograf√≠a, biofuncionalizaci√≥n o modificaciones qu√≠micas pueden ser aplicadas para incrementar la adhesi√≥n y la migraci√≥n de las c√©lulas endoteliales (ECs), y para controlar la aglomeraci√≥n de las plaquetas. El objetivo global de esta tesis es de obtener nuevas superficies modificadas para stent implantes con la habilidad de inducir una endotelizaci√≥n acelerada y de controlar la agregaci√≥n de plaquetas. Sobre CoCr, material de referencia para los stent met√°licos desnudos (BMSs), dos estrategias diferentes fueron evaluadas, la creaci√≥n de patrones lineales por la t√©cnica Direct Laser Interference Patterning (DLIP) y, la inmovilizaci√≥n de biomol√©culas. Sobre acido L-polil√°ctico (PLLA), como material para stent biodegradables (BRSs), la endotelizaci√≥n fue activada por funcionalizaci√≥n de la superficie v√≠a tratamientos con NaOH, plasma o enzima cutinasa. Patrones lineales de diferentes periodicidades y profundidades fueron obtenidos sobre superficies de CoCr. Despu√©s, los p√©ptidos Arg-Gly-Asp (RGD) y Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) fueron enganchados covalentemente por silanizaci√≥n sobre les superficies de CoCr lisas y con patrones. La adhesi√≥n de ECs aumento sobre las superficies funcionalizadas, especialmente con el p√©ptido YIGSR comparado con el RGD. Las superficies con patrones profundos generaron un alineamiento de las ECs con la direcci√≥n de las l√≠neas del patr√≥n y aceleraron la migraci√≥n de esas mismas c√©lulas. Adem√°s, el uso combinado de XV esas dos estrategias, topograf√≠a y biofuncionalizaci√≥n, acelero sin√©rgicamente la migraci√≥n y la proliferaci√≥n de las ECs. Por fin, la adhesi√≥n y la agregaci√≥n de plaquetas disminuyo sobre todas las superficies con patrones comparado con las superficies de CoCr lisas, efecto causado por los cambios de la capa de √≥xido introducido por la t√©cnica DLIP. Los estudios celulares demuestran el potencial de las topograf√≠as DLIP y de la biofuncionalizaci√≥n para mejorar la endotelizaci√≥n sin aumentar la adhesi√≥n de plaquetas, lo que puede ser interesante a la hora de dise√Īar nuevos stents. En cuanto a los stent biodegradables, pel√≠culas de PLLA fueron obtenidas por la t√©cnica de solvent-casting y, plasma de ox√≠geno, soluci√≥n de NaOH o enzima cutinasa fueron utilizados para funcionalizar esas pel√≠culas de PLLA y, as√≠ crear grupos hidroxilos y carboxilos en superficie sin comprometer la biocompatibilidad. Plasma de ox√≠geno y enzyma cutinasa generaron m√°s grupos funcionales y mejoraron m√°s la adhesi√≥n de ECs comparado con el tratamiento de NaOH. Adem√°s, las superficies de PLLA modificadas por plasma o enzima presentaron una degradaci√≥n similar a la degradaci√≥n de un stent comercial. Finalmente, BRSs de PLLA fueron obtenidos por impresi√≥n 3D v√≠a la t√©cnica de solvent-cast direct write. Consecuentemente, el uso combinado de esa t√©cnica y de la funcionalizaci√≥n por plasma o enzima presenta un gran potencial para fabricar BRSs de PLLA impreso en 3D con la capacidad de acelerar la endotelizaci√≥n de la superficie. En conclusi√≥n, esta tesis demuestra la efectividad de modificar las superficies de CoCr o PLLA con topograf√≠as espec√≠ficas o con estrategias de funcionalizaci√≥n para mejorar la endotelizaci√≥n y paralelamente reducir los riesgos de trombosis y reestenosis

    Novel functionalized and patterned surfaces for cardiovascular applications

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    Aplicat embargament des de la data de defensa fins 1/10/2018Cotutela Universitat Polit√®cnica de Catalunya i Universit√§t des SaarlandesNowadays, cardiovascular diseases are mainly treated by implantation of a metallic or polymeric mesh, called stent, which maintains the artery widely open. This technique shows very good clinical results, however, it exists non negligible cases of in stent restenosis (ISR) and late stent thrombosis (LST) during the first year after stent implantation. These complications are mainly due to a delayed recovery of the endothelium after stent implantation, which also involves smooth muscle cells (SMCs) over-proliferation and platelet aggregation. Stent surface modification to modulate a specific cell lineage response has not been comprehensively explored. In particular, surface nano topography, biofunctionalization or chemical features may be applied to increase endothelial cells (ECs) adhesion and/or migration, and to control platelet agglomeration. The overall aim of this thesis was to obtain novel modified surfaces for stents implants with the ability to induce accelerated reendothelialization and controlled platelet aggregation in order to avoid ISR and LST. On CoCr alloy, as the gold standard material for bare metal stents (BMSs), two different strategies were evaluated, generation of linear patterns by direct laser interference patterning (DLIP) and, immobilization of biomolecules. On poly(L-lactic acid) (PLLA), as a material for bioresorbable stents (BRSs), endothelialization was enhanced by surface functionalization with NaOH etching, plasma treatment and cutinase enzyme hydrolysis. CoCr alloy surfaces were successfully modified with a linear pattern of different periodicities and depths. Afterwards, Arg-Gly-Asp (RGD) and Tyr Ile Gly Ser Arg (YIGSR) peptides were covalently immobilized to the surfaces through silanization. Early ECs adhesion was improved on the peptide functionalized surfaces, especially for YIGSR compared to RGD. High depth nano patterned surfaces generated ECs alignment within the topographical lines and enhanced EC migration. Noteworthy, the combined use of both strategies, topography and biofunctionalization, synergistically accelerated the ECs migration and proliferation. Also, platelet adhesion and aggregation decreased in all patterned surfaces compared to smooth CoCr probably due to changes in wettability and oxide layer characteristics. Cellular studies provided evidence of the potential of DLIP topographies and YIGSR biofunctionalization to foster endothelialization without enhancement of platelet adhesion, which will be of high importance when designing new stents. Concerning polymeric biodegradable materials, PLLA films were obtained by solvent casting in chloroform and, oxygen plasma, NaOH solution or cutinase enzyme treatments were used to functionalize the PLLA films and create surface hydroxyl and carboxyl groups without compromising biocompatibility. A higher amount of functional groups and an improved ECs adhesion was observed by oxygen plasma and cutinase enzyme hydrolysis compared to NaOH etching. Plasma or cutinase enzyme functionalized PLLA films presented a degradation rate similar to a peripheral commercial stent. Finally, 3D printed PLLA BRSs were obtained by solvent-cast direct write technique. Consequently, the combined use of the solvent cast direct write technique and plasma or enzyme functionalization holds a great potential to fabricate 3D printed PLLA BRSs with the capacity to accelerate the surface endothelialization. Overall, the present thesis offers a comprehensive view of the effectiveness of modifying CoCr alloy and PLLA films with specific topographies or functionalization strategies to enhance surface endothelialization while preventing restenosis and thrombosis.Heutzutage werden vaskul√§re Erkrankungen haupts√§chlich durch Implantation eines metallischen oder polymeren Netzes, genannt Stent, behandelt, welcher vormals verengte Arterien weit ge√∂ffnet h√§lt. Diese Technik zeigt bereits sehr gute klinische Ergebnisse. Allerdings existieren auch nicht zu vernachl√§ssigende F√§lle von In-Stent Restenose (ISR) und sp√§ten Stentthrombosen (LST) im ersten Jahr nach Implantation des Stents. Diese Komplikationen entstehen haupts√§chlich aufgrund einer verz√∂gerten Erholung der Endothele nach Einsetzen des Stents, sowie durch √ľberm√§√üiges Wachstums der vaskul√§ren glatten Muskelzellen (SMCs) und einer Thrombozytenaggregation. Modifikationen der Stent-Oberfl√§che, um die Interaktion mit spezifischen Zellypen zu kontrollieren, sind noch nicht umfassend erforscht. Insbesondere k√∂nnen Oberfl√§chen-Nano-Topographie, Biofunktionalisierung oder chemische Modifizierungen angewendet werden, um die Adh√§sion und / oder Migration der Endothelzellen (ECs) zu erh√∂hen und die Agglomeration von Blutpl√§ttchen niedrig zu halten. Das Gesamtziel dieser Arbeit war es, neuartige modifizierte Oberfl√§chen f√ľr Stentimplantate zu entwickeln, die die Reendothelialisierung beschleunigen und eine Thrombozytenaggregation verringern, um ISR und LST vorzubeugen. Auf einer CoCr-Legierung, dem Gold-Standard-Material f√ľr unbeschichtete Metallstents (BMSs), wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt; einerseits die Erzeugung linearer Muster durch direkte Laserinterferenzstrukturierung (DLIP) und Immobilisierung von Biomolek√ľlen. Auf Poly (L-Milchs√§ure) (PLLA) als Material f√ľr bioresorbierbare Stents (BRSs) wurde die Endothelialisierung durch Oberfl√§chenfunktionalisierung mit NaOH-√Ątzen, mit einer Plasmabehandlung und mit Cutinase-Enzym-Hydrolyse verbessert. Zum anderen wurden Oberfl√§chen einer CoCr-Legierung erfolgreich mit einem Linien-Muster unterschiedlicher Periodizit√§t und Tiefe modifiziert. Anschlie√üend wurden Arg-Gly-Asp (RGD) und Tyr-lle-Gly-Ser-Arg (YIGSR) Peptide durch Silanisierung kovalent an den Oberfl√§chen immobilisiert. Die fr√ľhe ECs-Adh√§sion wurde auf den Peptid-funktionalisierten Oberfl√§chen verbessert, insbesondere f√ľr YIGSR im Vergleich zu RGD. Nanostrukturierte Oberfl√§chen mit gro√üer Tiefe erzeugten eine ECs-Ausrichtung innerhalb der topographischen Linien und f√∂rderten die EC-Migration und -Proliferation. Bemerkenswerterweise wurden diese synergetisch durch Kombination der zwei Strategien, Topographie und Biofunktionalisierung, beschleunigt. Auch die Thrombozytenadh√§sion und ‚Äďaggregation sanken in allen strukturierten Oberfl√§chen verglichen mit glattem CoCr, m√∂glicherweise auf Grund von Ver√§nderungen der Benetzbarkeit und der Oxidschichteigenschaften. Zellstudien belegen das Potential von DLIP-Topographien und YIGSR-Biofunktionalisierung, um die Endothelialisierung ohne Erh√∂hung der Thrombozytenadh√§sion zu f√∂rdern, was von gro√üer Bedeutung bei der Entwicklung neuer Stents sein wird. In Bezug auf polymere biologisch abbaubaren Materialien wurden PLLA-Schichten durch Solvent-Casting in Chloroform hergestellt. Sauerstoffplasma, NaOh-L√∂semittel oder Cutinase-Enzym-Behandlungen wurden genutzt, um die PLLA-Schichten zu funktionalisieren und Oberfl√§chen-Hydroxylgruppen und -Carboxylgruppen herzustellen, ohne die Biokompatibilit√§t zu beeintr√§chtigen. Im Vergleich zu NaOH-√Ątzen wurden durch Sauerstoffplasma und durch Cutinase-Enzym-Hydrolyse eine h√∂here Anzahl an funktionellen Gruppen und eine verbesserte ECs-Adh√§sion festgestellt. Plasma- oder Cutinase-Enzym-funktionalisierte PLLA-Schichten zeigten eine √§hnliche Degradation wie ein peripher, kommerzieller Stent. Abschlie√üend wurden 3D-gedruckte PLLA-BRSs durch Solvent-Cast Direct Writing hergestellt. Folglich bietet die Kombination aus Solvent-Cast Direct Writing und Plasma- oder Enzymfunktionalisierung ein gro√ües Potenzial, 3D-gedruckte PLLA-BRSs mit beschleunigter Oberfl√§chenendothelialisierung herzustellen. Insgesamt bietet die vorliegende Arbeit einen umfassenden √úberblick √ľber die Effektivit√§t der Modifizierung von CoCr-Legierung und PLLA-Filmen mit spezifischen Topographien oder Funktionalisierungsstrategien zur Verbesserung der Oberfl√§chenendothelialisierung bei gleichzeitiger Vermeidung von Restenose und ThromboseActualmente las enfermedades cardiovasculares est√°n principalmente tratadas por implantaci√≥n de una malla met√°lica o polim√©rica, llamada stent, que mantiene la arteria abierta. Esta t√©cnica presenta muy buenos resultados cl√≠nicos, sin embargo, existen casos de reestenosis intra-stent (ISR) y trombosis tardia del stent (LST) durante el a√Īo que sigue la implantaci√≥n. Estas complicaciones est√°n principalmente debidas a una reparaci√≥n demasiado lenta del endotelio despu√©s de la implantaci√≥n del stent; que tambi√©n implica una sobre-proliferaci√≥n de c√©lulas musculares lisas y una agregaci√≥n de plaquetas. La modificaci√≥n de la superficie del stent para generar una respuesta celular espec√≠fica no ha sido explorada en profundidad. Particularmente, nano-topograf√≠a, biofuncionalizaci√≥n o modificaciones qu√≠micas pueden ser aplicadas para incrementar la adhesi√≥n y la migraci√≥n de las c√©lulas endoteliales (ECs), y para controlar la aglomeraci√≥n de las plaquetas. El objetivo global de esta tesis es de obtener nuevas superficies modificadas para stent implantes con la habilidad de inducir una endotelizaci√≥n acelerada y de controlar la agregaci√≥n de plaquetas. Sobre CoCr, material de referencia para los stent met√°licos desnudos (BMSs), dos estrategias diferentes fueron evaluadas, la creaci√≥n de patrones lineales por la t√©cnica Direct Laser Interference Patterning (DLIP) y, la inmovilizaci√≥n de biomol√©culas. Sobre acido L-polil√°ctico (PLLA), como material para stent biodegradables (BRSs), la endotelizaci√≥n fue activada por funcionalizaci√≥n de la superficie v√≠a tratamientos con NaOH, plasma o enzima cutinasa. Patrones lineales de diferentes periodicidades y profundidades fueron obtenidos sobre superficies de CoCr. Despu√©s, los p√©ptidos Arg-Gly-Asp (RGD) y Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) fueron enganchados covalentemente por silanizaci√≥n sobre les superficies de CoCr lisas y con patrones. La adhesi√≥n de ECs aumento sobre las superficies funcionalizadas, especialmente con el p√©ptido YIGSR comparado con el RGD. Las superficies con patrones profundos generaron un alineamiento de las ECs con la direcci√≥n de las l√≠neas del patr√≥n y aceleraron la migraci√≥n de esas mismas c√©lulas. Adem√°s, el uso combinado de esas dos estrategias, topograf√≠a y biofuncionalizaci√≥n, acelero sin√©rgicamente la migraci√≥n y la proliferaci√≥n de las ECs. Por fin, la adhesi√≥n y la agregaci√≥n de plaquetas disminuyo sobre todas las superficies con patrones comparado con las superficies de CoCr lisas, efecto causado por los cambios de la capa de √≥xido introducido por la t√©cnica DLIP. Los estudios celulares demuestran el potencial de las topograf√≠as DLIP y de la biofuncionalizaci√≥n para mejorar la endotelizaci√≥n sin aumentar la adhesi√≥n de plaquetas, lo que puede ser interesante a la hora de dise√Īar nuevos stents. En cuanto a los stent biodegradables, pel√≠culas de PLLA fueron obtenidas por la t√©cnica de solvent-casting y, plasma de ox√≠geno, soluci√≥n de NaOH o enzima cutinasa fueron utilizados para funcionalizar esas pel√≠culas de PLLA y, as√≠ crear grupos hidroxilos y carboxilos en superficie sin comprometer la biocompatibilidad. Plasma de ox√≠geno y enzyma cutinasa generaron m√°s grupos funcionales y mejoraron m√°s la adhesi√≥n de ECs comparado con el tratamiento de NaOH. Adem√°s, las superficies de PLLA modificadas por plasma o enzima presentaron una degradaci√≥n similar a la degradaci√≥n de un stent comercial. Finalmente, BRSs de PLLA fueron obtenidos por impresi√≥n 3D v√≠a la t√©cnica de solvent-cast direct write. Consecuentemente, el uso combinado de esa t√©cnica y de la funcionalizaci√≥n por plasma o enzima presenta un gran potencial para fabricar BRSs de PLLA impreso en 3D con la capacidad de acelerar la endotelizaci√≥n de la superficie. En conclusi√≥n, esta tesis demuestra la efectividad de modificar las superficies de CoCr o PLLA con topograf√≠as espec√≠ficas o con estrategias de funcionalizaci√≥n para mejorar la endotelizaci√≥n y paralelamente reducir los riesgos de trombosis y reestenosisPostprint (published version

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The overall aim of this thesis was to obtain novel modified surfaces for stents implants with the ability to induce accelerated reendothelialization and controlled platelet aggregation in order to avoid ISR and LST. On CoCr alloy, as the gold standard material for bare metal stents (BMSs), two different strategies were evaluated, generation of linear patterns by direct laser interference patterning (DLIP) and, immobilization of biomolecules. On poly(L-lactic acid) (PLLA), as a material for bioresorbable stents (BRSs), endothelialization was enhanced by surface functionalization with NaOH etching, plasma treatment and cutinase enzyme hydrolysis. CoCr alloy surfaces were successfully modified with a linear pattern of different periodicities and depths. Afterwards, Arg-Gly-Asp (RGD) and Tyr Ile Gly Ser Arg (YIGSR) peptides were covalently immobilized to the surfaces through silanization. Early ECs adhesion was improved on the peptide functionalized surfaces, especially for YIGSR compared to RGD. High depth nano patterned surfaces generated ECs alignment within the topographical lines and enhanced EC migration. Noteworthy, the combined use of both strategies, topography and biofunctionalization, synergistically accelerated the ECs migration and proliferation. Also, platelet adhesion and aggregation decreased in all patterned surfaces compared to smooth CoCr probably due to changes in wettability and oxide layer characteristics. Cellular studies provided evidence of the potential of DLIP topographies and YIGSR biofunctionalization to foster endothelialization without enhancement of platelet adhesion, which will be of high importance when designing new stents. Concerning polymeric biodegradable materials, PLLA films were obtained by solvent casting in chloroform and, oxygen plasma, NaOH solution or cutinase enzyme treatments were used to functionalize the PLLA films and create surface hydroxyl and carboxyl groups without compromising biocompatibility. A higher amount of functional groups and an improved ECs adhesion was observed by oxygen plasma and cutinase enzyme hydrolysis compared to NaOH etching. Plasma or cutinase enzyme functionalized PLLA films presented a degradation rate similar to a peripheral commercial stent. Finally, 3D printed PLLA BRSs were obtained by solvent-cast direct write technique. Consequently, the combined use of the solvent cast direct write technique and plasma or enzyme functionalization holds a great potential to fabricate 3D printed PLLA BRSs with the capacity to accelerate the surface endothelialization. Overall, the present thesis offers a comprehensive view of the effectiveness of modifying CoCr alloy and PLLA films with specific topographies or functionalization strategies to enhance surface endothelialization while preventing restenosis and thrombosis.Heutzutage werden vaskul√§re Erkrankungen haupts√§chlich durch Implantation eines metallischen oder polymeren Netzes, genannt Stent, behandelt, welcher vormals verengte Arterien weit ge√∂ffnet h√§lt. Diese Technik zeigt bereits sehr gute klinische Ergebnisse. Allerdings existieren auch nicht zu vernachl√§ssigende F√§lle von In-Stent Restenose (ISR) und sp√§ten Stentthrombosen (LST) im ersten Jahr nach Implantation des Stents. Diese Komplikationen entstehen haupts√§chlich aufgrund einer verz√∂gerten Erholung der Endothele nach Einsetzen des Stents, sowie durch √ľberm√§√üiges Wachstums der vaskul√§ren glatten Muskelzellen (SMCs) und einer Thrombozytenaggregation. Modifikationen der Stent-Oberfl√§che, um die Interaktion mit spezifischen Zellypen zu kontrollieren, sind noch nicht umfassend erforscht. Insbesondere k√∂nnen Oberfl√§chen-Nano-Topographie, Biofunktionalisierung oder chemische Modifizierungen angewendet werden, um die Adh√§sion und / oder Migration der Endothelzellen (ECs) zu erh√∂hen und die Agglomeration von Blutpl√§ttchen niedrig zu halten. Das Gesamtziel dieser Arbeit war es, neuartige modifizierte Oberfl√§chen f√ľr Stentimplantate zu entwickeln, die die Reendothelialisierung beschleunigen und eine Thrombozytenaggregation verringern, um ISR und LST vorzubeugen. Auf einer CoCr-Legierung, dem Gold-Standard-Material f√ľr unbeschichtete Metallstents (BMSs), wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt; einerseits die Erzeugung linearer Muster durch direkte Laserinterferenzstrukturierung (DLIP) und Immobilisierung von Biomolek√ľlen. Auf Poly (L-Milchs√§ure) (PLLA) als Material f√ľr bioresorbierbare Stents (BRSs) wurde die Endothelialisierung durch Oberfl√§chenfunktionalisierung mit NaOH-√Ątzen, mit einer Plasmabehandlung und mit Cutinase-Enzym-Hydrolyse verbessert. Zum anderen wurden Oberfl√§chen einer CoCr-Legierung erfolgreich mit einem Linien-Muster unterschiedlicher Periodizit√§t und Tiefe modifiziert. Anschlie√üend wurden Arg-Gly-Asp (RGD) und Tyr-lle-Gly-Ser-Arg (YIGSR) Peptide durch Silanisierung kovalent an den Oberfl√§chen immobilisiert. Die fr√ľhe ECs-Adh√§sion wurde auf den Peptid-funktionalisierten Oberfl√§chen verbessert, insbesondere f√ľr YIGSR im Vergleich zu RGD. Nanostrukturierte Oberfl√§chen mit gro√üer Tiefe erzeugten eine ECs-Ausrichtung innerhalb der topographischen Linien und f√∂rderten die EC-Migration und -Proliferation. Bemerkenswerterweise wurden diese synergetisch durch Kombination der zwei Strategien, Topographie und Biofunktionalisierung, beschleunigt. Auch die Thrombozytenadh√§sion und ‚Äďaggregation sanken in allen strukturierten Oberfl√§chen verglichen mit glattem CoCr, m√∂glicherweise auf Grund von Ver√§nderungen der Benetzbarkeit und der Oxidschichteigenschaften. Zellstudien belegen das Potential von DLIP-Topographien und YIGSR-Biofunktionalisierung, um die Endothelialisierung ohne Erh√∂hung der Thrombozytenadh√§sion zu f√∂rdern, was von gro√üer Bedeutung bei der Entwicklung neuer Stents sein wird. In Bezug auf polymere biologisch abbaubaren Materialien wurden PLLA-Schichten durch Solvent-Casting in Chloroform hergestellt. Sauerstoffplasma, NaOh-L√∂semittel oder Cutinase-Enzym-Behandlungen wurden genutzt, um die PLLA-Schichten zu funktionalisieren und Oberfl√§chen-Hydroxylgruppen und -Carboxylgruppen herzustellen, ohne die Biokompatibilit√§t zu beeintr√§chtigen. Im Vergleich zu NaOH-√Ątzen wurden durch Sauerstoffplasma und durch Cutinase-Enzym-Hydrolyse eine h√∂here Anzahl an funktionellen Gruppen und eine verbesserte ECs-Adh√§sion festgestellt. Plasma- oder Cutinase-Enzym-funktionalisierte PLLA-Schichten zeigten eine √§hnliche Degradation wie ein peripher, kommerzieller Stent. Abschlie√üend wurden 3D-gedruckte PLLA-BRSs durch Solvent-Cast Direct Writing hergestellt. Folglich bietet die Kombination aus Solvent-Cast Direct Writing und Plasma- oder Enzymfunktionalisierung ein gro√ües Potenzial, 3D-gedruckte PLLA-BRSs mit beschleunigter Oberfl√§chenendothelialisierung herzustellen. Insgesamt bietet die vorliegende Arbeit einen umfassenden √úberblick √ľber die Effektivit√§t der Modifizierung von CoCr-Legierung und PLLA-Filmen mit spezifischen Topographien oder Funktionalisierungsstrategien zur Verbesserung der Oberfl√§chenendothelialisierung bei gleichzeitiger Vermeidung von Restenose und ThromboseActualmente las enfermedades cardiovasculares est√°n principalmente tratadas por implantaci√≥n de una malla met√°lica o polim√©rica, llamada stent, que mantiene la arteria abierta. Esta t√©cnica presenta muy buenos resultados cl√≠nicos, sin embargo, existen casos de reestenosis intra-stent (ISR) y trombosis tardia del stent (LST) durante el a√Īo que sigue la implantaci√≥n. Estas complicaciones est√°n principalmente debidas a una reparaci√≥n demasiado lenta del endotelio despu√©s de la implantaci√≥n del stent; que tambi√©n implica una sobre-proliferaci√≥n de c√©lulas musculares lisas y una agregaci√≥n de plaquetas. La modificaci√≥n de la superficie del stent para generar una respuesta celular espec√≠fica no ha sido explorada en profundidad. Particularmente, nano-topograf√≠a, biofuncionalizaci√≥n o modificaciones qu√≠micas pueden ser aplicadas para incrementar la adhesi√≥n y la migraci√≥n de las c√©lulas endoteliales (ECs), y para controlar la aglomeraci√≥n de las plaquetas. El objetivo global de esta tesis es de obtener nuevas superficies modificadas para stent implantes con la habilidad de inducir una endotelizaci√≥n acelerada y de controlar la agregaci√≥n de plaquetas. Sobre CoCr, material de referencia para los stent met√°licos desnudos (BMSs), dos estrategias diferentes fueron evaluadas, la creaci√≥n de patrones lineales por la t√©cnica Direct Laser Interference Patterning (DLIP) y, la inmovilizaci√≥n de biomol√©culas. Sobre acido L-polil√°ctico (PLLA), como material para stent biodegradables (BRSs), la endotelizaci√≥n fue activada por funcionalizaci√≥n de la superficie v√≠a tratamientos con NaOH, plasma o enzima cutinasa. Patrones lineales de diferentes periodicidades y profundidades fueron obtenidos sobre superficies de CoCr. Despu√©s, los p√©ptidos Arg-Gly-Asp (RGD) y Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) fueron enganchados covalentemente por silanizaci√≥n sobre les superficies de CoCr lisas y con patrones. La adhesi√≥n de ECs aumento sobre las superficies funcionalizadas, especialmente con el p√©ptido YIGSR comparado con el RGD. Las superficies con patrones profundos generaron un alineamiento de las ECs con la direcci√≥n de las l√≠neas del patr√≥n y aceleraron la migraci√≥n de esas mismas c√©lulas. Adem√°s, el uso combinado de esas dos estrategias, topograf√≠a y biofuncionalizaci√≥n, acelero sin√©rgicamente la migraci√≥n y la proliferaci√≥n de las ECs. Por fin, la adhesi√≥n y la agregaci√≥n de plaquetas disminuyo sobre todas las superficies con patrones comparado con las superficies de CoCr lisas, efecto causado por los cambios de la capa de √≥xido introducido por la t√©cnica DLIP. Los estudios celulares demuestran el potencial de las topograf√≠as DLIP y de la biofuncionalizaci√≥n para mejorar la endotelizaci√≥n sin aumentar la adhesi√≥n de plaquetas, lo que puede ser interesante a la hora de dise√Īar nuevos stents. En cuanto a los stent biodegradables, pel√≠culas de PLLA fueron obtenidas por la t√©cnica de solvent-casting y, plasma de ox√≠geno, soluci√≥n de NaOH o enzima cutinasa fueron utilizados para funcionalizar esas pel√≠culas de PLLA y, as√≠ crear grupos hidroxilos y carboxilos en superficie sin comprometer la biocompatibilidad. Plasma de ox√≠geno y enzyma cutinasa generaron m√°s grupos funcionales y mejoraron m√°s la adhesi√≥n de ECs comparado con el tratamiento de NaOH. Adem√°s, las superficies de PLLA modificadas por plasma o enzima presentaron una degradaci√≥n similar a la degradaci√≥n de un stent comercial. Finalmente, BRSs de PLLA fueron obtenidos por impresi√≥n 3D v√≠a la t√©cnica de solvent-cast direct write. Consecuentemente, el uso combinado de esa t√©cnica y de la funcionalizaci√≥n por plasma o enzima presenta un gran potencial para fabricar BRSs de PLLA impreso en 3D con la capacidad de acelerar la endotelizaci√≥n de la superficie. En conclusi√≥n, esta tesis demuestra la efectividad de modificar las superficies de CoCr o PLLA con topograf√≠as espec√≠ficas o con estrategias de funcionalizaci√≥n para mejorar la endotelizaci√≥n y paralelamente reducir los riesgos de trombosis y reestenosi

    Direct laser interference patterning of CoCr alloy surfaces to control endothelial cell and platelet response for cardiovascular applications

    No full text
    The main drawbacks of cardiovascular bare-metal stents (BMS) are in-stent restenosis and stent thrombosis as a result of an incomplete endothelialization after stent implantation. Nano- and microscale modification of implant surfaces is a strategy to recover the functionality of the artery by stimulating and guiding molecular and biological processes at the implant/tissue interface. In this study, cobalt-chromium (CoCr) alloy surfaces are modified via direct laser interference patterning (DLIP) in order to create linear patterning onto CoCr surfaces with different periodicities (ňú3, 10, 20, and 32 ¬Ķm) and depths (ňú20 and 800 nm). Changes in surface topography, chemistry, and wettability are thoroughly characterized before and after modification. Human umbilical vein endothelial cells' adhesion and spreading are similar for all patterned and plain CoCr surfaces. Moreover, high-depth series induce cell elongation, alignment, and migration along the patterned lines. Platelet adhesion and aggregation decrease in all patterned surfaces compared to CoCr control, which is associated with changes in wettability and oxide layer characteristics. Cellular studies provide evidence of the potential of DLIP topographies to foster endothelialization without enhancement of platelet adhesion, which will be of high importance when designing new BMS in the future.Peer Reviewe
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