4 research outputs found

    Сравнительный анализ протеомного профиля кератиноцитов HaCaT с использованием 1DE-гель концентрирования

    Get PDF
    Using tandem mass spectrometry with electrospray ionization, a comparative analysis of HaCaT keratinocyte proteins was carried out before and after exposure of cells to sodium dodecyl sulfate (25 mg/ml) for 48 hours; proteins encoded by human chromosome 18 genes were chosen as the comparison proteins. A total of 2418 proteins were detected in the HaCaT immortalized human keratinocytes, 70% of these proteins were identified by two or more unique peptides. Panoramic mass spectrometry analysis identified 38 proteins encoded by chromosome 18 genes, 27 proteins were common to control HaCaT cells and HaCaT cells exposed to SDS. Using the Metascape database (https://metascape.org), an enrichment analysis of GO terms of the Biological Process category of chromosome 18 gene encoded proteins of HaCaT keratinocytes was performed before and after the SDS exposure. The SDS exposure resulted in a slight enrichment of the GO term "response to stimulus" (GO:0050896) and the related GO term "negative regulation of biological process" (GO:0048519). We found decreased expression levels of membrane proteins encoded by chromosome 18 genes related to cell-cell adhesion (GO:0098609), such as DSC1, DSC3, and DSG1. A decrease in the expression level of desmosomal cadherins is characteristic of malignant neoplasms developing from epithelial tissue cells of various internal organs, mucous membranes, and skin. The method of preparation of HaCaT keratinocyte samples used in this work increased the sensitivity of proteomic analysis of cell culture and made it possible to identify twice as many proteins in one gel strip as compared to the number of proteins (1284) in HaCaT samples subjected to osmotic shock and cleavage by trypsin in solution.Проведена оценка протокола пробоподготовки образцов клеточной культуры кератиноцитов, основанного на солюбилизации белков в присутствии 0.2% додецилсульфата натрия (SDS), процедуре 1DE-гель концентрирования (SDS-PAGE без фракционирования в разделяющем геле) и расщеплении трипсином в геле для углубленного протеомного анализа кератиноцитов НаСаТ в одной полосе белка. С помощью тандемной масс-спектрометрии с электроспрейной ионизацией (LC-MS/MS) проведен сравнительный анализ белков кератиноцитов НаСаТ до и после воздействия SDS в субтоксической дозе (25 мг/мл) в течение 48 ч. В качестве белков сравнения выбраны белки, кодируемые генами хромосомы 18 человека. Всего в иммортализованных кератиноцитах человека линии НаСаТ обнаружено 2418 белков, из них около 70% идентифицировано по двум и более уникальным пептидам. По результатам панорамного масс-спектрометрического анализа удалось идентифицировать 38 белков, кодируемых генами хромосомы 18; из них 27 белков были общими для контрольных клеток и клеток НаСаТ, подвергнутых воздействию SDS. С использованием базы данных Metascape был проведен анализ обогащения терминами онтологии генов (GO) категории биологические процессы (biological process) белков хромосомы 18 кератиноцитов НаСаТ до и после воздействия SDS. Обработка клеточной культуры SDS приводила к незначительному обогащению GO термина “ответ на стимул” (GO:0050896 - response to stimulus) и связанного с ним GO термина “негативная регуляция биологических процессов” (GO:0048519 - negative regulation of biological process). Было обнаружено снижение уровня экспрессии мембранных белков, кодируемых генами хромосомы 18, относящихся к межклеточной адгезии (GO:0098609 - cell-cell adhesion), таких как DSC1, DSC3 и DSG1. Снижение уровня экспрессии десмосомальных кадгеринов характерно для злокачественных новообразований, развивающихся из клеток эпителиальной ткани различных внутренних органов, слизистых оболочек, кожи. Примененный в работе способ подготовки образцов кератиноцитов НаСаТ позволил идентифицировать в одной полосе геля в два раза больше белков по сравнению с образцами НаСаТ, подвергнутыми осмотическому шоку и расщеплению трипсином в растворе

    Идентификация белков плазмы крови человека с использованием внутренних пептидных стандартов в панорамном протеомном анализе

    No full text
    LC-MS/MS allows identification of thousands of proteins in the complex proteomes. However, a significant part of a proteome remains inaccessible for identification due to the absence or poor quality of MS/MS spectra. The method described herein allows identifying the desired proteins of human blood plasma by comparing aligned chromatographic data of digested by trypsin sample and the same sample with spikedin synthetic peptides. Identification of human blood plasma proteins is archived by assigning tandem mass spectra of spiked-in peptides to the corresponding aligned chromatographic peaks of proteolytic peptides. Using the described approach we have identified 19 low abundant proteins in human blood plasma, which corresponded to 19 synthetic peptides used in the study. SRM verification of the identifications with isotopically labelled standards (SIS) confirmed the presence in the plasma of above 17 proteins.Использование метода панорамной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) позволяет идентифицировать в сложных протеомах до нескольких тысяч белков. Однако значительная часть протеома остается недоступной для идентификации из-за отсутствия или плохого качества МС/МС спектров. Описываемый в данной работе метод повышает вероятность идентификации белков плазмы крови человека путем выравнивания хроматографических данных образца смеси протеолитических пептидов и этого же образца, разбавленного синтетическими пептидами. Такая идентификация происходит в результате сопоставления тандемных масс-спектров синтетических пептидов с соответствующими выровненными хроматографическими пиками протеолитических пептидов. Используя данный подход, мы выявили 19 низко представленных белков плазмы крови человека, соответствующих 19 синтетическим пептидам, выбранным для исследования. Проверка идентификаций методом мониторинга диссоциативных переходов с изотопно-мечеными стандартами подтвердила наличие в плазме 17 белков

    Протеомный анализ ворсин хориона человека при анэмбрионии

    No full text
    In this study, the proteomic approach based on high performance liquid chromatography connected with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and bioinformatics analysis were applied to identify differentially abundant proteins in chorionic villus samples (CVS) from women with blighted ovum and normal pregnancy. We identified about 600 proteins in the solubilized fraction of CVS. Comparative proteomic analysis revealed differences in the content (Average Normalized Abundances) of 187 proteins in blighted ovum. These included 134 down-regulated proteins and 53 up-regulated proteins. According to bioinformatics analysis these proteins participate in a variety of metabolic processes, including alcohol and tricarboxylic acid metabolism, response to endoplasmic reticulum stress, small molecular catabolic process, cellular respiration, and others. Proteins that demonstrated growing content in blighted ovum were mainly encoded by genes located on chromosomes 7 and 16 whereas proteins which demonstrated reducing abundance were mainly encoded by genes located on chromosomes 1, 2, and 11. We also revealed changes in the content of proteins encoded by genes located on the human chromosome 18; they are involved in apoptotic and drug metabolic processes with an important role in early pregnancy loss. Our pilot results demonstrate the efficiency of the LC-MS/MS approach for detecting the differences at the qualitative and semi-quantitative levels in the protein profiles of the CVS at anembryonic pregnancy compared to normal gestation. We conclude that globally profiled and differentially regulated proteins of CVS are helpful in obtaining molecular insights into biological processes of the pregnancy pathology.В данной работе протеомный подход, основанный на жидкостной хроматографии, совмещенной с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS), и биоинформатический анализ были применены для выявления различий между белковым профилем ворсин хориона человека при анэмбриональной беременности по сравнению с нормальной. Всего в солюбилизированной фракции хориона было идентифицировано около 600 белков. Сравнительный протеомный анализ с использованием программного обеспечения Progenesis LS-MS показал изменение содержания 187 белков при анэмбрионии, из них 134 белка продемонстрировали снижение и 53 белка – повышение концентрации (average normalized abundances). Биоинформатический анализ свидетельствует, что эти белки принимают участие в различных метаболических процессах, включая метаболизм алкоголя и трикарбоновых кислот, в реакциях, ассоциируемых со стрессом эндоплазматического ретикулума, процессах катаболизма, клеточном дыхании и других. Кроме того, зарегистрировано изменение содержания белков, кодируемых хромосомой 18 человека, принимающих участие в апоптозе и реакциях метаболизма лекарственных средств, а также процессах, играющих важную роль при потерях в ранние сроки беременности. Наши предварительные результаты демонстрируют эффективность LC-MS/MS для выявления качественных и полуколичественных различий белкового профиля ворсин хориона при анэмбриональной беременности по сравнению с нормальной. Сделан вывод о том, что широкомасштабное профилирование дифференциально регулируемых белков ворсин хориона может быть полезно для понимания биологических процессов, протекающих при патологии беременности
    corecore