21 research outputs found

    Оценка коллатеральной активности CRISPR/Cas13a-рибонуклеазы на биоанализаторе Agilent 2100

    Get PDF
    The paper describes an original technique for detecting the collateral activity of CRISPR/Cas 13a ribonuclease based on the assessment of ribosomal RNA degradation. The Agilent 2100 bioanalyzer is used as an analyzing device. This approach is an alternative to existing detection methods and has a number of advantages over them in the case when a quantitative assessment of activity is not required. On the example of the test sample, the optimal concentrations and ratios of the components of the reaction mixture, which are necessary to obtain the most indicative result, were determined. The proposed technique can be used for qualitative assessment of the activity of recombinant ribonuclease Cas13a preparations obtained under different conditions of heterologous protein expression and purification, as well as for testing guide RNAs.В работе описывается оригинальная методика детекции коллатеральной активности CRISPR/Cas13a-рибонуклеазы, основанная на оценке деградации рибосомальной РНК. В качестве анализирующего прибора используется биоанализатор Agilent 2100. Данный подход является альтернативой существующим методам детекции и имеет ряд преимуществ по сравнению с ними в том случае, когда не требуется количественная оценка активности. На примере тестового образца определены оптимальные концентрации и соотношения компонентов реакционной смеси, необходимые для получения наиболее показательного результата. Предлагаемая методика может быть использована для качественной оценки активности препаратов рекомбинантной рибонуклеазы Cas13а, полученных при разных условиях гетерологической экспрессии белка и его очистки, а также для тестирования направляющих РНК

    Алгоритм создания таргетных масс-спектрометрических методов для детекции белков

    Get PDF
    Determination of protein concentration in biological samples is an important task for biological research, as well as for medicine and routine clinical biochemistry. The introduction of stable isotope-labeled peptide standards (SIS) made it possible to determine accurately absolute protein concentrations in proteomic studies. The correct choice of SIS and the systematic way to develop a s method for selected reaction monitoring (SRM) are very important steps that are crucial for further identification and measurements of protein concentration. In this paper, we summarize our experience of selecting SIS for measuring the protein concentration by SRM. The results are presented in the form of an algorithm that describes the main stages of the SIS selection and the main points in the development of SRM methods for the targeted protein detection and determination of protein concentrations in biological samples.Определение концентраций белков является важной задачей в биологии и медицине, а также используется в клинической лабораторной практике для диагностики заболеваний. Измерения абсолютных концентраций белков в масс-спектрометрии стали возможны благодаря внедрению в практику внутренних стандартов, которые в точности соответствуют химической структуре измеряемого вещества, но синтезированы с использованием изотопно-меченых молекул. Правильный выбор внутреннего стандарта и систематических подход в разработке методики мониторинга выбранных реакций (Selected Reaction Monitoring, SRM) определяет качество идентификации и точность измерения концентрации таргетного белка. В данной работе суммирован наш опыт по выбору пептидного стандарта для измерения концентрации белков. Результаты представлены в виде алгоритма, который учитывает основные стадии выбора внутреннего стандарта и основные моменты разработки методов детекции и определения концентрации белко

    Постгеномная медицина: альтернатива биомаркерам

    Get PDF
    In the article relevance of high-performance postgenomic technologies is tackled. The intrinsic problems of the implementation of genomics, proteomics and metabolomics in routine clinical practice are considered. Further development of postgenomic medicine requires severe change in the current research approaches. Avenue for development of such approaches are illustrated by metabolome research of human blood plasma. The postgenomic biomarkers are pictured as molecular iceberg, greater part of which is inaccessible for detection with measurement methods. Due to diversity of protein forms the spectrum of molecular markers will always evaluate in terms of incompleteness and inconsistence regardless of technological development level. These properties of «big data» are typical of data intensive domains. Special computational methods are essential for data intensive analytics and hardly suitable for the evidence-based medicine.В статье обсуждается востребованность достижений высокопроизводительных постгеномных технологий. Рассматриваются причины, препятствующие внедрению геномики, протеомики и метаболомики в рутинную клиническую практику.  Устранение этих причин и дальнейшее развитие постгеномной медицины требует принципиального изменения существующих исследовательских подходов. Возможности для развития таких подходов иллюстрируются на примере выполненных на базе ИБМХ им. В.Н. Ореховича  исследований метаболома плазмы крови человека. Ситуация с поиском постгеномных биомаркеров иллюстрируется молекулярным айсбергом, большая часть которого недоступна для детектирования измерительными методами. С учетом многообразия форм РНК и белков, возникающего в результате всевозможных модификаций кодируемых геномом продуктов, наблюдаемый спектр молекулярных маркеров всегда, независимо от уровня развития технологий, будет характеризоваться неполнотой и противоречивостью. Эти свойства характерны для так называемых "больших данных" (Big Data), для работы с которыми нужны специальные вычислительные методы, которые могут оказаться слабосовместимыми с в принципом доказательности в медицине

    Обработка длинных чтений транскриптомного секвенирования на облачной вычислительной платформе amazon web services

    Get PDF
    Studies of genomes and transcriptomes are performed using sequencers that read the sequence of nucleotide residues of genomic DNA, RNA, or complementary DNA (cDNA). The analysis consists of an experimental part (obtaining primary data) and bioinformatic processing of primary data. The bioinformatics part is performed with different sets of input parameters. The selection of the optimal values of the parameters, as a rule, requires significant computing power. The article describes a protocol for processing transcriptome data by virtual computers provided by the cloud platform Amazon Web Services (AWS) using the example of the recently emerging technology of long DNA and RNA sequences (Oxford Nanopore Technology). As a result, a virtual machine and instructions for its use have been developed, thus allowing a wide range of molecular biologists to independently process the results obtained using the "Oxford nanopore".Исследования геномов и транскриптомов проводят с помощью секвенаторов, позволяющих считывать последовательность нуклеотидных остатков геномной ДНК, РНК или комплементарной ДНК. Каждое секвенирование биополимеров состоит из экспериментальной части (получение первичных данных) и их обработки средствами биоинформатики с использованием различных наборов входных параметров и значительных вычислительных мощностей. В статье описан протокол обработки транскриптома человека с применением виртуальных вычислительных машин, предоставляемых облачной платформой Amazon Web Services (AWS). Свободно и комерчески доступные возможности AWS рассмотрены с учетом требований к вычислительным ресурсам недавно анонсированной технологии длинных прочтений последовательностей ДНК и РНК («Oxford Nanopore Technology», Великобритания). Как результат нами был развернута виртуальная вычислительная машина в рамках доступных на AWS систем облачных решений и разработана инструкция для работы с ней, позволяющая молекулярным биологам самостоятельно адаптировать представленные вычислительные возможности для обработки результатов, полученных с использованием нанопорового секвенатора

    Перспективы использования секвенаторов третьего поколения для количественного профилирования транскриптома

    Get PDF
    Transcriptome profiling is widely employed to analyze transcriptome dynamics when studying various biological processes at the cell and tissue levels. Unlike the second generation sequencers, which sequence relatively short fragments of nucleic acids, the third generation DNA/RNA sequencers developed by biotechnology companies “PacBio” and “Oxford Nanopore Technologies” allow one to sequence transcripts as single molecules and may be considered as potential molecular counters capable to measure the number of copies of each transcript with high throughput, sensitivity, and specificity. In the present review, the features of single molecule sequencing technologies offered by “PacBio” and “Oxford Nanopore Technologies” are considered alongside with their utility for transcriptome analysis, including the analysis of transcript isoforms. The prospects and limitations of the single molecule sequencing technology in application to quantitative transcriptome profiling are also discussed.Транскриптомное профилирование широко используется для анализа динамики транскриптома при исследовании различных биологических процессов на клеточном и тканевом уровне. В отличие от секвенаторов второго поколения, которые секвенируют относительно короткие фрагменты нуклеиновых кислот, ДНК/РНК секвенаторы третьего поколения, разработанные биотехнологическими компаниями “PacBio” и “Oxford Nanopore Technologies”, позволяют секвенировать транскрипты как единичные молекулы и могут рассматриваться как потенциальные молекулярные счётчики, способные измерять количество копий каждого транскрипта с высокой производительностью, чувствительностью и специфичностью. В данном обзоре рассмотрены особенности технологий одномолекулярного секвенирования, предлагаемых компаниями “PacBio” и “Oxford Nanopore Technologies”, и применение технологий одномолекулярного секвенирования для целей транскриптомного анализа, включая анализ изоформ транкриптов. Также обсуждаются перспективы и ограничения их использования для количественного профилирования транскриптома

    Dielectronic recombination rate in statistical model

    No full text
    The dielectronic recombination rate of multielectron ions was calculated by means of the statistical approach. It is based on an idea of collective excitations of atomic electrons with the local plasma frequencies. These frequencies are expressed via the Thomas-Fermi model electron density distribution. The statistical approach provides fast computation of DR rates that are compared with the modern quantum mechanical calculations. The results are important for current studies of thermonuclear plasmas with the tungsten impurities

    Стандартизация препаратов рекомбинантной CRISPR/Cas13a-нуклеазы с использованием РНКазы А с известной активностью

    No full text
    The approach to characterize preparations of recombinant Cas13a-nuclease in terms of specific collateral activity has been proposed for standardization of enzyme preparations. The standardization of Cas13a preparations by the specific activity may benefit both the development of assays employing Cas13a collateral ribonuclease activity and the optimization of ribonuclease expression, purification, and storage. The approach is based on measurement of the initial rate of a cleavage of specially designed commercially available RNA molecules (“reporters” labelled with a fluorophore and a quencher) by a preparation of recombinant Cas13a-nuclease and commercial RNase A of known activity. This requires the optimization of a molar ratio for the formation of Cas13a complexes with guide RNA as well as the optimization of amount of the RNA target. The use of a synthetic RNA target appears preferable compared with total RNA preparations.Предложен подход к характеризации препаратов рекомбинантной Cas13a-нуклеазы в терминах удельной коллатеральной активности для их стандартизации. Стандартизация препаратов Cas13a-нуклеазы по удельной активности будет полезна как при разработке тестов, использующих коллатеральную рибонуклеазную активность Cas13a, так и для оптимизации процедур экспрессии, очистки и хранения рибонуклеазы. Подход основан на измерении начальной скорости расщепления специально созданных и коммерчески доступных образцов молекул РНК (FQ-репортеров, меченных флуорофором и химическим соединением – гасителем флуоресценции) препаратом рекомбинантной Cas13a-нуклеазы и коммерческой РНКазой А с известной активностью. В качестве предварительного условия необходимо найти оптимальное молярное соотношение для образования комплексов Cas13a с направляющей РНК (нРНК), а также оптимальное количество РНК-мишени. Использование синтетической РНК-мишени представляется предпочтительным по сравнению с препаратами суммарной РНК

    Прямая детекция микроРНК mir-34a, -145 и -218 с помощью CRISPR/Cas13a-нуклеазы

    No full text
    Using CRISPR/Cas13a-nuclease we have demonstrated a feasibility of direct detection of three miRNAs, miR-34a, -145, and -218 (their molecular signature is suggested as a diagnostic and prognostic biomarker in cervical cancer),. The detection is based on registration of a cleavage of molecular reporters bearing a fluorophore and a quencher by the complex of CRISPR/Cas13a-nuclease and guide RNA (gRNA) with a spacer of 21-23 nucleotides long. The detection sensitivity varied among miRNAs tested by 10-fold, presumably due to the unwanted intramolecular partial base paring of gRNA. The miRNA detection with Cas13a nuclease strongly depended on the presence of background RNA thus potentially compromising its direct application to complex media in a general case. Further optimization of measurement conditions including probably an additional amplification of the signal generated by collateral activity of Cas13a nuclease is necessary to directly detect miR-34a, -145, and -218 in biological samples.Показана возможность прямой детекции трех микроРНК, miR-34a, -145 и -218 (чья молекулярная сигнатура предлагается как диагностический и прогностический биомаркер при раке шейки матки), с помощью CRISPR/Cas13a-нуклеазы. Детекция основано на регистрации расщепления молекулярных «репортеров» – коротких РНК-олигонуклеотидов, несущих флуорофор и гаситель – комплексом CRISPR/Cas13a-нуклеазы и направляющей РНК (нРНК) со спейсером длиной 21-23 нуклеотида. Чувствительность обнаружения варьировала 10-кратно среди тестированных микроРНК, предположительно из-за нежелательного внутримолекулярного частичного спаривания оснований нРНК. Обнаружено, что детекция микроРНК с помощью нуклеазы Cas13a сильно зависит от присутствия фоновой РНК, что в общем случае может затруднить такую детекцию в сложном матриксе. Дальнейшая оптимизация условий измерения, включая, вероятно, дополнительное усиление сигнала, генерируемого коллатеральной активностью нуклеазы Cas13a, необходима для прямой детекции miR-34a, -145 и -218 в биологических образцах

    Перспективы использования секвенаторов третьего поколения для количественного профилирования транскриптома

    No full text
    Transcriptome profiling is widely employed to analyze transcriptome dynamics when studying various biological processes at the cell and tissue levels. Unlike the second generation sequencers, which sequence relatively short fragments of nucleic acids, the third generation DNA/RNA sequencers developed by biotechnology companies “PacBio” and “Oxford Nanopore Technologies” allow one to sequence transcripts as single molecules and may be considered as potential molecular counters capable to measure the number of copies of each transcript with high throughput, sensitivity, and specificity. In the present review, the features of single molecule sequencing technologies offered by “PacBio” and “Oxford Nanopore Technologies” are considered alongside with their utility for transcriptome analysis, including the analysis of transcript isoforms. The prospects and limitations of the single molecule sequencing technology in application to quantitative transcriptome profiling are also discussed.Транскриптомное профилирование широко используется для анализа динамики транскриптома при исследовании различных биологических процессов на клеточном и тканевом уровне. В отличие от секвенаторов второго поколения, которые секвенируют относительно короткие фрагменты нуклеиновых кислот, ДНК/РНК секвенаторы третьего поколения, разработанные биотехнологическими компаниями “PacBio” и “Oxford Nanopore Technologies”, позволяют секвенировать транскрипты как единичные молекулы и могут рассматриваться как потенциальные молекулярные счётчики, способные измерять количество копий каждого транскрипта с высокой производительностью, чувствительностью и специфичностью. В данном обзоре рассмотрены особенности технологий одномолекулярного секвенирования, предлагаемых компаниями “PacBio” и “Oxford Nanopore Technologies”, и применение технологий одномолекулярного секвенирования для целей транскриптомного анализа, включая анализ изоформ транкриптов. Также обсуждаются перспективы и ограничения их использования для количественного профилирования транскриптома

    Идентификация рибосомных футпринтов на электрофоретическом геле при профилировании транслатома: использование ДНК-маркёров

    No full text
    The commercial DNA ladder was tested as a substitute for RNA size standards to identify ribosomal footprints (RNA fragments of about 30 nucleotides long) on an electrophoretic polyacrylamide gel for the purposes of translatome profiling. It has been found that 25 and 35 nucleotides long synthetic RNA oligonucleotides do migrate slower than the synthetic DNA oligonucleotides of the matching length and sequences and their positions on the gel coincide with those of 30 and 40 nucleotides long DNA oligonucleotides, correspondingly, of the commercial IDT 20/100 DNA oligo length standards. By using this DNA ladder and RNA isolated from the preparation enriched in ribosomes (obtained by fractionating on MicroSpin S-400 columns the HepG2 cell lysate treated with RNase I), the position of a band of putative ribosomal footprints can be identified on a gel that has been verified by measuring in an RNA-seq experiment the length of RNA fragments extracted from the band.Коммерческие ДНК-маркёры тестировали как замену РНК-стандартов длины молекулы для идентификации рибосомных футпринтов (фрагментов РНК длиной около 30 нуклеотидов) на электрофоретическом полиакриламидном геле при профилировании транслатома. Было обнаружено, что синтетические РНК-олигонуклеотиды длиной 25 и 35 нуклеотидов мигрируют медленнее, чем синтетические ДНК-олигонуклеотиды соответствующей длины и последовательностей, и их положение на геле совпадает с положением ДНК- олигонуклеотидов длиной 30 и 40 нуклеотидов соответственно из коммерческого набора стандартов длин ДНК-олигонуклеотидов «IDT 20/100 DNA oligo length standards». Используя данный набор и РНК, выделенную из препарата, обогащенного рибосомами (полученного фракционированием на колонках MicroSpin S-400 клеточного лизата HepG2, обработанного РНКазой I), можно идентифицировать положение полосы предполагаемых рибосомных футпринтов на геле, что было подтверждено измерением длины фрагментов РНК, выделенных из полосы, при проведении их секвенирования методом RNA-seq
    corecore