540 research outputs found

    Cyclic behavior of a two-span RC beam built with plain reinforcing bars

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    Reinforced concrete structural elements lacking appropriate seismic detailing and built with plain reinforcing bars, and subjected to cyclic loads like the ones induced by earthquakes, are particularly sensitive to the bond-slip mechanism. Though, existing studies on the cyclic behavior of RC structures generally refer to elements with deformed bars. As a result, the behavior of elements with plain bars is not yet fully understood. In this framework, the cyclic behavior of a two-span RC beam built with plain reinforcing bars, collected from an ancient building structure, was investigated. The support and loading conditions observed in-situ were simulated in the test setup. The beam displayed a flexural failure and the damage was concentrated in three short plastic hinges. The poor damage distribution evidences the effects of the bar slippage mechanism on the beam behaviorFCT - SFRH/BD/27406/2006FCT - SFRH/BD/62110/200

    Functional analysis of the SUMO conjugation/deconjugation system during the development and stress response of Arabidopsis thaliana

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    Tese de doutoramento em Ci√™ncias (√°rea de especializa√ß√£o em Biologia)Living organisms are subjected to constantly changing environmental conditions that compromise survival. Perception of these changes precedes the triggering of signaling events that ultimately activate an adequate response. Since plants are sessile organisms they are considerably more exposed to an instable environment, having adopted a wide range of strategies to adapt, avoid or tolerate stress. Knowledge on the molecular basis of these strategies will be key for future crop improvement, particularly with a rapidly changing environment. Several studies have singled out how fast and reversible responses to stress correlate with post-translational modification (PTM) of key proteins. An increasingly important mechanism involves protein modification by small peptides such as ubiquitin and other ubiquitin-like modifiers (UBLs). Focus on small ubiquitin-related modifier (SUMO), a UBL family member, has increased massively in the last years. SUMO attachment, or sumoylation, may exert different effects depending on the target protein, controlling its conformation, or even creating or blocking interacting interfaces. To be attached to a target, pre-SUMO peptides are first processed by SUMO proteases (ULP/SENP family), and then conjugated to a target‚Äôs lysine via SUMO E1 activases and SUMO E2 conjugases, aided by SUMO E3 ligases. Deconjugation of the SUMO peptide can be carried out by SUMO proteases. In plants, SUMO homeostasis is critical because mutations in pathway components result in embryonic lethality or pleiotropic phenotypes. One interesting feature of SUMO is that SUMO-conjugates accumulate rapidly upon stress imposition, placing SUMO in the forefront of the plant response to stress, most likely associated to transcriptional re-programming. Studies of SUMO function in plants have been based mostly on reverse genetics approaches in the plant model Arabidopsis thaliana. Similarly, we employed T-DNA insertion mutants to characterize the role of the major SUMO E3 ligase SIZ1 and SUMO proteases ULP1c, ULP1d, ULP2a and ULP2b in the plant stress response. Reactive oxygen species (ROS) are known internal signals caused by stress that can induce SUMO-conjugate accumulation. In the present work we addressed SUMO-ROS interplay, and report that SIZ1 is essential for SUMO-conjugate induction in response to ROS, and is involved in oxidative stress tolerance. Additionally, siz1 mutants displayed altered ROS homeostasis, constitutively accumulating hydrogen peroxide, superoxide ion and singlet oxygen. The siz1 phenotype was partially dependent of salicylic acid (SA) levels since several siz1 defects were greatly recovery by the expression of the transgenic salicylate hydroxylase NahG. The siz1 mutant displays constitutive autoimmune phenotypes, including SA-accumulation. Analysis of oxidative stress-responsive targets of sumoylation suggests a major role for transcription remodeling proteins in the SUMO-dependent response to oxidative stress. Bioinformatic analysis revealed that the transcriptome profile of adult siz1 is similar to that of mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway mutants. These also share common features of autoimmune responses, such as the accumulation of ROS. Results suggest a crosstalk between the SUMO and MAPK pathways, but a direct interaction between MKK2-MPK4 and SUMOs or in vitro sumoylation of MKK2-MPK4 was not observed. Nonetheless, we introgressed mkk1/2 and mpk4 mutants into siz1, and sumoylation profiles suggest that MPK4 acts as a negative regulator while MKK1/2 is seemingly epistatic to SIZ1. In contrast to the low number of components involved in SUMO conjugation, there are several SUMO proteases in plants. SUMO proteases are sources of selectivity, since they can discriminate different SUMO isoforms and targets to be de-sumoylated. They also display different expression patterns and subcellular localizations. We report how phylogenetic reconstruction of the Arabidopsis ULP family outlines the existence of two major branches, and within these, four phylogenetic subgroups. We characterized two of these subgroups, one composed by ULP1c/ULP1d and another by ULP2a/ULP2b. We show how ULP1c/d function redundantly to regulate several developmental traits. Using GUS report assays we also established their spatial expression pattern. A microarray analysis of differentially expressed genes in a double T-DNA insertion mutant was carried out, suggesting a deregulation of drought and abscisic acid-related genes. Taking this into consideration, a characterization of related phenotypes was performed in the double mutant. We additionally demonstrated how ULP1c/d are negative regulators of the plant response against the hemibiotroph pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000. The response is however complex, since infection triggered down-regulation of ULP1c and ULP1d transcripts, which may correlate with the observed increase in SUMO-conjugates that follows infection. Analysis of the transcriptome of ulp1c/d after Pst DC3000 challenging revealed the existence of many de-regulated genes involved in both biotic stress responses and hormonal signaling, including auxin-responsive genes. We subsequently observed ulp1c/d sensitivity to exogenous auxins. Overall results suggest a ULP1c/d-dependent modulation of auxin in response to Pst DC3000. ULP2a and ULP2b were structural and phylogenetically characterized, revealing a set of common features with ULP2-type proteases of other biological models. T-DNA insertion mutants for this ULP pair were characterized, showing diverse phenotypic defects and constitutive accumulation of SUMO-conjugates. ULP2a and ULP2b displayed unequal redundancy, placing ULP2b as the most preponderant. Microarray analysis evidenced a specific transcriptional signature that suggests the involvement of ULP2s in secondary metabolism, cell wall remodelling and nitrogen assimilation. The ulp2a/b mutant also displayed an antagonistic morphological phenotype to that of the well characterized SUMO E3 ligase mutant siz1. Most significantly, the triple mutant ulp2a/b siz1 was phenotypically siz1-like, which places ULP2a/b as epistatic and downstream of SIZ1. The current work highlights the importance of both SIZ1 and various SUMO proteases in development and the plant response to external challenges. Subsequent functional studies will help unravel the fundamental role that SUMO dynamics seems to play at a molecular level, in the control of plant development, hormone regulation, stress response and transcription programming.Os organismos vivos est√£o constantemente sujeitos a altera√ß√Ķes ambientais que comprometem a sua sobreviv√™ncia. A percep√ß√£o destas altera√ß√Ķes precede eventos de sinaliza√ß√£o que culminam na activa√ß√£o de uma resposta adequada. Dado as plantas serem organismos s√©sseis, elas est√£o consideravelmente mais expostas a ambientes inst√°veis, tendo desenvolvido um vasto leque de estrat√©gias para adaptar, evitar ou tolerar o stresse. O conhecimento das bases moleculares subjacentes a estas estrat√©gias √© chave para o melhoramento de cultivares de interesse, especialmente estando estes sujeitos a ambientes inst√°veis. Diversos estudos t√™m evidenciado como respostas r√°pidas e revers√≠veis se correlacionam com mecanismos de modifica√ß√£o p√≥s-tradu√ß√£o (PTM) de prote√≠nas-chave. Mecanismos de reconhecida import√Ęncia envolvem modifica√ß√Ķes por pequenos p√©ptidos como a ubiquitina e modificadores semelhantes √† ubiquitina (UBLs). O estudo do pequeno modificador relacionado com ubiquitina (small ubiquitin-related modifier; SUMO), um membro da fam√≠lia UBL, tem sido crescente nos √ļltimos anos. A liga√ß√£o do SUMO a uma prote√≠na (sumoila√ß√£o) poder√° exercer diferentes efeitos consoante a prote√≠na-alvo, controlando a sua conforma√ß√£o, e criando, ou bloqueando, interfaces de interac√ß√£o. Para ser ligado a um alvo, o p√©ptido pre-SUMO ter√° que ser inicialmente processado por SUMO proteases (fam√≠lia ULP/SENP), e ent√£o conjugado ao res√≠duo de lisina do alvo atrav√©s de SUMO E1 activases e SUMO E2 conjugases, auxiliadas por SUMO E3 ligases. A desconjuga√ß√£o do SUMO poder√° ser levada a cabo por SUMO proteases. Em plantas, a homeostasia do SUMO √© fundamental uma vez que muta√ß√Ķes em componentes da via resultam em letalidade embrion√°ria ou em fen√≥tipos pleiotr√≥picos. Um aspecto interessante do SUMO √© o facto dos seus conjugados serem acumulados rapidamente em resposta ao stresse, posicionando o SUMO nos primeiros passos da resposta da planta ao stresse, muito possivelmente associada √† reprograma√ß√£o transcripcional. Estudos da fun√ß√£o do SUMO em plantas assentam maioritariamente em estrat√©gias de gen√©tica inversa onde √© utilizada a esp√©cie modelo Arabidopsis thaliana (Arabidopsis). De forma semelhante, o presente estudo utilizou mutantes de Arabidopsis por inser√ß√£o de T-DNA para caracterizar o papel da SUMO E3 ligase SIZ1 e das SUMO proteases ULP1c, ULP1d, ULP2a e ULP2b na resposta da planta ao stresse. As esp√©cies reactivas de oxig√©nio (ROS) est√£o descritas como sendo sinalizadores internos originados pelo stresse que podem induzir a acumula√ß√£o de conjugados de SUMO. No presente trabalho foi abordada a interac√ß√£o SUMO-ROS, tendo-se obtido evid√™ncias de que SIZ1 √© essencial para a indu√ß√£o de conjugados de SUMO em resposta a ROS, estando SIZ1 envolvida na toler√Ęncia ao stresse oxidativo. Adicionalmente, os mutantes siz1 revelam altera√ß√Ķes na homeostasia das ROS, acumulando constitutivamente per√≥xido de hidrog√©nio, i√£o super√≥xido e oxig√©nio singleto. O fen√≥tipo de siz1 √© parcialmente dependente dos n√≠veis de √°cido salic√≠lico (SA) uma vez que os defeitos fenot√≠picos de siz1 s√£o grandemente recuperados pela express√£o do transgene salicilato hidrolase NahG. O mutante siz1 apresenta um fen√≥tipo de auto-imunidade constitutiva, incluindo a acumula√ß√£o de SA. A an√°lise dos alvos de sumoila√ß√£o que respondem a stresse oxidativo sugere um papel preponderante de prote√≠nas reguladoras da transcri√ß√£o na resposta ao stresse oxidativo dependente do SUMO. A an√°lise bioinform√°tica revelou que o padr√£o do transcriptoma de siz1 √© semelhante ao de mutantes da via das MAP cinases (MAPK). Estes apresentam tamb√©m caracter√≠sticas de resposta auto-imune, como a acumula√ß√£o de ROS. Os resultados sugerem uma intercep√ß√£o entre as vias do SUMO e MAPK, por√©m n√£o foram observadas interac√ß√Ķes entre MPK4 e p√©ptidos SUMO, ou sumoila√ß√£o in vitro de MKK2-MPK4. Contudo, as plantas resultantes da introgress√£o de mutantes mkk1/2 e mpk4 com siz1 apresentam padr√Ķes de sumoilados alterados, permitindo sugerir a MPK4 como sendo um regulador negativo da sumoila√ß√£o, enquanto as MKK1/2 poder√£o ser epist√°ticas de SIZ1. Em contraste com o n√ļmero limitado de componentes da via de conjuga√ß√£o do SUMO, em plantas existem v√°rias SUMO proteases. As SUMO proteases s√£o uma fonte de selectividade, uma vez que s√£o capazes de discriminar isoformas de SUMOs e descriminar alvos a serem dessumoilados, reconhecem diferencialmente isoformas do SUMO, possuem diferentes padr√Ķes de express√£o e diferente localiza√ß√£o subcelular. A reconstru√ß√£o filogen√©tica da fam√≠lia ULP de Arabidopsis evidenciou a exist√™ncia de dois grandes ramos, divididos em quatro subgrupos filogen√©ticos. Procedemos √† caracteriza√ß√£o de dois destes subgrupos, um composto por ULP1c/ULP1d e outro por ULP2a/ULP2b. Foi demonstrado que as ULP1c/d funcionam redundantemente na regula√ß√£o de diversos aspectos do desenvolvimento. Recorrendo a ensaios pelo gene rep√≥rter GUS, foi poss√≠vel estabelecer o padr√£o de express√£o espacial destes genes. Analise por microarray de genes diferencialmente expressos no duplo mutante de inser√ß√£o por T-DNA para ambos genes identificou uma desregula√ß√£o de genes envolvidos na secura e √°cido absc√≠sico. Tendo este resultado em considera√ß√£o, uma caracteriza√ß√£o de fen√≥tipos relacionados com estes processos foi realizada no duplo mutante. Demonstrou-se igualmente que as ULP1c/d s√£o reguladores negativos na defesa da planta ao microorganismo patog√©nico hemibiotr√≥fico Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000. No entanto esta resposta √© complexa j√° que a infec√ß√£o diminui os n√≠veis de transcritos de ULP1c e ULP1d, o que poder√° estar correlacionado com o aumento de conjugados de SUMO que se seguem √† infec√ß√£o. Uma an√°lise do transcriptoma do ulp1c/d ap√≥s elicia√ß√£o com Pst DC3000 revelou a exist√™ncia de muitos genes desregulados envolvidos nas respostas ao stresse bi√≥tico e sinaliza√ß√£o hormonal, incluindo genes de resposta a auxinas. Em suma, os resultados apontam para um papel das ULP1c/d na modeliza√ß√£o das auxinas em resposta a Pst DC3000. ULP2a e ULP2b foram caracterizadas estrutural e filogeneticamente, revelando um conjunto de caracter√≠sticas comuns √†s proteases do tipo ULP2 de outros modelos biol√≥gicos. Mutantes por inser√ß√£o de T-DNA para este par de ULP mostraram diversos defeitos fenot√≠picos e uma acumula√ß√£o constitutiva de conjugados de SUMO. ULP2a e ULP2b apresentam redund√Ęncia desigual, sendo ULP2b a mais preponderante. A an√°lise por microarray evidenciou uma assinatura transcripcional especifica que sugere o envolvimento das ULP2s no metabolismo secund√°rio, remodela√ß√£o da parede celular e assimila√ß√£o de azoto. O mutante ulp2a/b apresenta tamb√©m um fen√≥tipo morfol√≥gico antag√≥nico ao fen√≥tipo bem caracterizado do mutante da SUMO E3 ligase SIZ1. Foi interessante constatar que o triplo mutante ulp2a/b siz1 √© fenotipicamente semelhante a siz1, colocando as ULP2a/b numa posi√ß√£o epist√°tica e a jusante de SIZ1. O presente trabalho salienta a import√Ęncia tanto de SIZ1 como de v√°rias SUMO proteases na resposta da planta a desafios externos. Estudos funcionais subsequentes permitir√£o revelar, ao n√≠vel molecular, pap√©is fundamentais da din√Ęmica do SUMO no controlo do desenvolvimento, da regula√ß√£o hormonal, da resposta ao stresse e da programa√ß√£o transcripcional

    Type II and type V CRISPR effector nucleases from a structural biologist’s perspective

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    The type II and type V CRISPR effector nucleases Cas9 and Cpf1 are ‚Äúuniversal‚ÄĚ DNA endonucleases, which can be programmed by an appropriate crRNA or sgRNA strand to cleave almost any DNA duplex at a preselected position (constrained only by short, so-called PAMs). In this review, we briefly introduce CRISPR bacterial adaptive immunity as the biological context in which Cas9 and Cpf1 proteins operate, and then present the structural insights that have been obtained in the last two or three years that illustrate the mode of operation of these proteins. We describe the R-loop structures at the core of the Cas9 and Cpf1 complexes, and the structure of the 5‚Äô- or 3‚Äô-handles that help anchor the nucleic acid complexes to the proteins in a manner that is independent of the target sequence. Next, we describe the molecular architecture of the Cas9 and Cpf1 proteins. We illustrate how Cas9 and Cpf1 proteins scan double stranded DNA for so-called protospacer associated motifs (PAMs), we explain how the phosphate loop (PLL) and basic helix (BH) promote the separation of target and non-target DNA strands and the formation of hybrids between crRNA or sgRNA and the target strand of DNA. We also describe the current understanding of the catalytic mechanisms of RuvC and HNH domains, and a possible, but still very uncertain catalytic role of the Nuc domain. At the end of the review, we briefly summarize key developments that have initiated the field of genomic engineering using Cas9 or Cpf1 nucleases

    Microfibers for juice analysis by solid-phase microextraction.

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    In view of the interest in analyzing volatile compounds by SPME, the following five microfibers were tested, polydimethylsiloxane; polyacrylate; polydimethylsiloxane/divinylbenzene; carboxen/polydimethylsiloxane, and carbowax/divinylbenzene, to select the one which presents the best performance for the adsorption of the volatile compounds present in the headspace of acid lime juice samples. Sample stabilization time variations (30 and 60 minutes) were assessed as well the addition of NaCl to the samples. It was verified that the chromatogram with the most adsorbed volatile compounds was obtained with PDMS/DVB microfiber at 30 minutes and the addition of 0.2 g NaCl

    La acción político-discrursiva del empresariado paulista en al coyuntura de crisis del segundo mandato de Dilma Rousseff

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    Esta investigaci√≥n maestral ha buscado comprender el discurso del empresariado paulista, representado por la Federaci√≥n de las Industrias del Estado de S√£o Paulo, en tanto un actor social con relevante agencia pol√≠tica durante la coyuntura reciente de crisis sist√©mica del segundo mandato de Dilma Rousseff, de octubre 2014 a diciembre 2016. Enmarcado por la perspectiva pluralista de las √©lites y los conceptos de articulaci√≥n y movilizaci√≥n, se analiz√≥ el discurso pol√≠tico de la √©lite empresarial a partir de sus notas oficiales, utilizando el software Atlas.ti, estableciendo una codificaci√≥n en funci√≥n del marco te√≥rico y de las variables elementos ideol√≥gicos, actores e instituciones, articulaci√≥n, movilizaci√≥n y cr√≠ticas o proposiciones. Como resultado se percibe un proceso de protagonizaci√≥n a nivel nacional para la manipulaci√≥n hacia la homogeneizaci√≥n del sentido de la opini√≥n p√ļblica; la transformaci√≥n hegem√≥nica de acci√≥n pol√≠tico-discursiva en tanto un actor social de intereses empresariales e industriales fragmentados. Se nota el fortalecimiento del corporativismo institucionalizado, beneficios selectivos e institucionalismo asociativo con prominencia de las grandes entidades empresariales establecidas, que incluye la Fiesp con quien comparten cuerpo directivo. Se descubre que la campa√Īa pol√≠tica del empresariado fue un instrumento de movilizaci√≥n vertical con la opini√≥n p√ļblica, mientras el discurso sostiene movilizaciones horizontales con otros grupos de poder; adem√°s del acercamiento ideol√≥gico entre el empresariado y el presidente Michel Temer, que se transform√≥ en oposici√≥n a Dilma Roussef

    Análise do comportamento cíclico de nós viga-pilar representativos de estruturas de B.A. com armadura lisa

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    As estruturas de bet√£o armado constru√≠das at√© meados dos anos 70, com armadura lisa e sem dimensionamento espec√≠fico face √† ac√ß√£o s√≠smica, s√£o tipicamente caracterizadas por pormenoriza√ß√£o deficiente da armadura, confinamento inadequado e fracas propriedades de ader√™ncia a√ßo-bet√£o. A conjun√ß√£o destes factores com as elevadas concentra√ß√Ķes de esfor√ßos nas liga√ß√Ķes viga-pilar, fazem destas liga√ß√Ķes um dos pontos prop√≠cios √† concentra√ß√£o de danos, aquando da ocorr√™ncia de um sismo. A ader√™ncia a√ßo-bet√£o condiciona o desempenho das estruturas. A degrada√ß√£o progressiva da ader√™ncia em elementos sujeitos a ac√ß√Ķes c√≠clicas severas, promove o escorregamento das armaduras, sendo esta uma das causas comuns de dano e colapso das estruturas devido √† ac√ß√£o dos sismos. Neste artigo s√£o apresentados os principais resultados de seis ensaios c√≠clicos em n√≥s viga-pilar constru√≠dos com armadura lisa, e com diferentes quantidades e pormenoriza√ß√£o de armadura. S√£o tamb√©m apresentados os resultados comparativos do ensaio c√≠clico de um n√≥ de refer√™ncia com armadura nervurada, com geometria, quantidade e pormenoriza√ß√£o de armadura iguais a um dos provetes com armadura lisa. Para melhor compreender a influ√™ncia deste mecanismo no comportamento c√≠clico dos n√≥s, √© estabelecida a compara√ß√£o entre os resultados experimentais dos n√≥s semelhantes, um com armadura lisa e o outro com armadura nervurada. Os resultados obtidos evidenciam a import√Ęncia de considerar o escorregamento nos modelos num√©ricos a fim de reproduzir de forma adequada o comportamento real deste tipo de estruturas

    Análise do comportamento de nós viga-pilar com armadura lisa sujeitos a cargas horizontais cíclicas

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    O comportamento c√≠clico dos elementos de bet√£o armado √© fortemente influenciado pelo mecanismo de ader√™ncia a√ßo-bet√£o. A degrada√ß√£o progressiva da ader√™ncia, com a consequente ocorr√™ncia do escorregamento das armaduras, √© umas das causas comuns de dano e colapso de estruturas de bet√£o armado sujeitas a ac√ß√Ķes severas, como as induzidas pelos sismos. Os efeitos do escorregamento s√£o particularmente importantes em elementos com armadura lisa, caracter√≠sticos das estruturas de edif√≠cios de bet√£o armado constru√≠das antes dos anos 70. Para al√©m das fracas caracter√≠sticas de ader√™ncia, estas estruturas s√£o tamb√©m tipicamente caracterizadas pela pormenoriza√ß√£o deficiente das suas armaduras. A conjun√ß√£o destes factores, associada √† elevada concentra√ß√£o de esfor√ßos verificada nas liga√ß√Ķes viga-pilar, faz com que nestas zonas se concentre o dano em edif√≠cios de bet√£o armado devido a ac√ß√Ķes s√≠smicas. Neste artigo s√£o apresentados os principais resultados de uma s√©rie de ensaios c√≠clicos realizados em n√≥s viga-pilar com armadura lisa, constru√≠dos com quantidades e pormenoriza√ß√£o de armadura semelhantes e sujeitos a diferentes solicita√ß√Ķes. Estes elementos s√£o representativos de n√≥s interiores de estruturas de edif√≠cios de bet√£o armado constru√≠das at√© finais dos anos 70. S√£o tamb√©m apresentados, para compara√ß√£o, os resultados do ensaio c√≠clico de um n√≥ id√™ntico aos anteriores, mas constru√≠do com armadura nervurada. Esta compara√ß√£o permitiu compreender a influ√™ncia que o escorregamento das armaduras tem na resposta c√≠clica de n√≥s interiores viga-pilar com armadura lisa, e comprova que a sua considera√ß√£o √© indispens√°vel para reproduzir de forma rigorosa o comportamento real deste tipo de estruturas

    Wine Quality Assessment under the Eindhoven Classification Method

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    The identification, classification and recording of events leading to deterioration of wine quality is essential for developing appropriate strategies to avoid them. This work introduces an adverse event reporting and learning system that can help preventing hazards and ensure the quality of the wines. The Eindhoven Classification Method (ECM) has been extended and adapted to the incidents of the wine industry. Logic Programming (LP) was used for Knowledge Representation and Reasoning (KRR) in order to model the universe of discourse, even in the presence of incomplete data, information or knowledge. On the other hand, the evolutionary process of the body of knowledge is to be understood as a process of energy devaluation, enabling the automatic extraction of knowledge and the generation of reports to identify the most relevant causes of errors that can lead to a poor wine quality. In addition, the answers to the problem are object of formal evidence through theorem proving
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