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Transcritômica e proteômica aplicadas à prospecção de genes candidatos envolvidos na resposta de defesa aos estresses biótico e abiótico em Arachis spp.
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.Muitos fatores bióticos e abióticos podem limitar a produtividade e a qualidade dos
grãos de amendoim, especialmente considerando que essa cultura é amplamente cultivada
nos trópicos semiáridos e por agricultores com poucos recursos. Tanto a seca quanto os
nematoides das galhas (Meloidogyne spp.) são problemas que afetam não apenas a
cultura do amendoim, mas também outras culturas, representando uma ameaça mundial à
produção agrícola e a segurança alimentar. O amendoim (Arachis hypogaea) apresenta
alta suscetibilidade a diferentes estresses ambientais e ataques de patógenos. Por outro
lado, seus parentes silvestres apresentam maior adaptabilidade a ambientes adversos e
resistência a inúmeros fitopatógenos, mostrando-se importantes fontes de resistência
alélica aos estresses bióticos e abióticos para o melhoramento genético do amendoim.
Neste estudo, proteínas obtidas a partir de tecidos radiculares tanto de plantas de A.
duranensis submetidas a diminuição gradual de água no solo quanto de plantas de A.
stenosperma inoculadas com nematoide das galhas, foram analisadas, assim como sua
abundância diferencial em relação aos perfis de expressão de seus transcritos
correspondentes obtidos por RNA-Seq e RT-qPCR. Utilizando a abordagem 2-DE, um total
de 31 proteínas diferencialmente abundantes (DAPs) foram identificadas em raízes de A.
duranensis e 21 em raízes de A. stenosperma. Além disso, 222 DAPs também foram
identificadas pela análise 2D-NanoUPLC-MSE em raízes de A. stenosperma. A correlação
entre a abundância proteica e a expressão do mRNA correspondente (in silico e in vitro)
mostrou que enquanto a dinâmica de resposta ao estresse hídrico foi preferencialmente
negativamente regulada em raízes estressadas de A. duranensis, em raízes de A.
stenosperma infectadas com nematoide foi positivamente regulada. Entre as proteínas aqui
identificadas, duas proteínas relacionadas a patogênese (PRs), ambas responsivas à seca
e uma delas responsiva também ao ataque do nematoide, foram selecionadas para
avaliação quanto ao efeito de sua superexpressão em resposta a esses estresses. Este
estudo demonstra a utilidade de estudos proteômicos e sua correlação com dados de
transcrição, na identificação de genes e reguladores envolvidos na resposta de defesa ao
estresse biótico e abiótico em espécies com relativamente poucos recursos genômicos
como o Arachis. As proteínas identificadas são potencialmente úteis para o melhoramento
genético do amendoim cultivado visando a tolerância à seca e a resistência ao ataque de
patógenos.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Pesquisas (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF).Many biotic and abiotic factors may limit the productivity and quality of peanut grains,
especially considering that this crop is widely cultivated in the semi-arid tropics and by poor
farmers. Both drought and root-knot nematodes (RKN – Meloidogyne spp.) are problems
that affect not only the peanut crop, but also other crops, posing a worldwide threat to
agricultural production and food security. Peanut (Arachis hypogaea) presents high
susceptibility to different environmental stresses and pathogen attacks. On the other hand,
its wild relatives show greater adaptability to adverse environments and resistance to
numerous phytopathogens, proving to be important sources of resistance alleles to biotic
and abiotic stresses for the genetic improvement of peanuts. In this study, proteins obtained
from root tissues of both A. duranensis plants subjected to the gradual reduction of water in
the soil and from A. stenosperma plants inoculated with RKN were analyzed, as well as
their differential abundance in relation to the profiles of their corresponding transcripts
obtained by RNA-seq and RT-qPCR. Using the 2-DE approach, a total of 31 differentially
abundant proteins (DAPs) were identified in roots of A. duranensis and 21 in roots of A.
stenosperma. In addition, 222 DAPs were also identified by 2D-NanoUPLC-MSE analysis
on A. stenosperma roots. The correlation between protein abundance and the expression
of the corresponding mRNA (in silico and in vitro) showed that while the dynamics of
response to water deficit was preferentially negatively regulated in stressed roots of A.
duranensis, roots of A. stenosperma infected with nematoid was positively regulated.
Among the proteins identified herein, two pathogenesis-related proteins (PRs), both
responsive to drought and one of them also responsive to nematode attack, were selected
for evaluation as to the effect of their overexpression in response to these stresses. In
addition, this study demonstrates the usefulness of proteomic studies and their correlation
with transcription data, in the identification of genes and regulators involved in the defense
response to biotic and abiotic stress in species with relatively few genomic resources such
as Arachis. The identified proteins are potentially useful for the genetic improvement of
cultivated peanuts aiming at drought tolerance and resistance to pathogen attack
Prospecção e validação de genes-candidatos envolvidos na resistência de amendoim silvestre (Arachis stenosperma) ao Passalora personata, o agente causal da mancha preta do amendoim
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2011.O amendoim cultivado (Arachis hypogaea) é umas das oleaginosas mais importantes no mundo, pelo seu grande valor energético e nutricional. Contudo, o amendoim possui baixa variabilidade genética quando consideradas características de interesse agronômico, o que difere de suas espécies silvestres, as quais são fontes de resistência a doenças e de adaptação a diversos ambientes. Arachis stenosperma é uma espécie silvestre resistente a algumas pragas e doenças, dentre elas, a mancha preta do amendoim, causada pelo fungo Passalora personata. Visando a identificação de genescandidatos associados à resposta de defesa da planta, o transcritoma de plantas de A. stenosperma acesso V10309, desafiadas com o fungo P. personata, e seu controle, foram analisados através de pirossequencimento massal (Roche), resultando em 362.631 genes transcritos, o que gerou 17.912 unigenes, dos quais 7.723 eram constituídos por contigs. Dentre as anotações obtidas por BLASTx, 50 fatores de transcrição, 48 RGAs e vários genes-candidatos envolvidos em processos de defesa da planta foram identificados. Dentre eles, 16 genes-candidatos, cinco deles RGAs, foram avaliados através de RT-qPCR, quanto ao nível de expressão mediante a presença do patógeno, sendo cinco dos 11 primeiros, negativamente regulados, enquanto que todos os RGAs foram positivamente regulados. Esta é a primeira análise massal do transcritoma de espécie silvestre de Arachis inoculado com P. personata. Os dados gerados neste trabalho promoverão o enriquecimento do banco de dados de genes transcritos de A. stenosperma, os quais poderão ser utilizados para descoberta de genes-candidatos à resistência, a outras características de interesse agronômico e novos marcadores moleculares (SNPs e SSRs), que uma vez mapeados, poderão auxiliar na identificação de QTLs no melhoramento da cultura do amendoim, constituindo um importante recurso para a comunidade científica interessada na descoberta de genes relacionados à resposta de defesa ou ao estresse biótico em amendoim e em outras espécies. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTPeanut (Arachis hypogaea) is one of the most important oilseeds in the world due to its high energy value and nutrition. However, peanut has a low genetic variability, especially for agronomical traits, which differs from its wild species, which are sources of disease resistance and adaptation to various environments. Arachis stenosperma is a wild species resistant to some pests and diseases, among them, the Late Leaf Spot, caused by the fungus Passalora personata. Aiming to identify candidate genes associated with the plant defense response, the transcriptome of A. stenosperma V10309, challenged with the fungus P. personata and from a non-infected control, was analyzed by large scale pyrosequencing (Roche), resulting in 362,631 expressed genes, which generated 17,912 unigenes, which consisted of 7,723 contigs. Among the annotations obtained by BLASTx, 50 transcription factors, 48 RGAs and several candidate genes involved in plant defense processes were identified. Among them, 16 candidate genes were analyzed through RTqPCR for expression in the presence of the pathogen. Five RGAs were up-regulated, whilst the other 11 were down-regulated. This is the first large scale report on the transcriptome analysis of wild peanut inoculated with P. personata. The data generated in this study promote the enrichment of the database of expressed genes from A. stenosperma, which can be used for discovery of candidate genes resistance, other agronomic traits of interest and new molecular markers (SNPs and SSRs). Once mapped, these can assist in the identification of QTLs in peanut crop improvement. This data is an important resource to the scientific community in the discovery of genes related to defense response or biotic stress in peanuts and other species
Defining the combined stress response in wild Arachis
International audienceNematodes and drought are major constraints in tropical agriculture and often occur simultaneously. Plant responses to these stresses are complex and require crosstalk between biotic and abiotic signaling pathways. In this study, we explored the transcriptome data of wild Arachis species subjected to drought (A-metaDEG) and the root-knot nematode Meloidogyne arenaria (B-metaDEG) via meta-analysis, to identify core-stress responsive genes to each individual and concurrent stresses in these species. Transcriptome analysis of a nematode/drought bioassay (cross-stress) showed that the set of stress responsive DEGs to concurrent stress is distinct from those resulting from overlapping A- and B-metaDEGs, indicating a specialized and unique response to combined stresses in wild Arachis . Whilst individual biotic and abiotic stresses elicit hormone-responsive genes, most notably in the jasmonic and abscisic acid pathways, combined stresses seem to trigger mainly the ethylene hormone pathway. The overexpression of a cross-stress tolerance candidate gene identified here, an endochitinase-encoding gene ( AsECHI ) from Arachis stenosperma , reduced up to 30% of M. incognita infection and increased post-drought recovery in Arabidopsis plants submitted to both stresses. The elucidation of the network of cross-stress responsive genes in Arachis contributes to better understanding the complex regulation of biotic and abiotic responses in plants facilitating more adequate crop breeding for combined stress tolerance