Application of novel methodologies for the detection of mutations in dystrophin patients that do not have deletions on the dystrophin gene

IntroductionMutation detection in the DMD gene has historically been challenging, duemainly to the large size of the gene and the fact that over 90% of the pointmutations are unique. Although hot spots have been reported for exondeletions and duplications no such spot has been identified for pointmutations which are scattered across the whole gene.Materials and MethodsIn our study we present a general overview of the molecular analysis findingsin 645 patients (608 male and 37 female) referred to our department duringthe past 2 decades for DMD gene testing. Exon deletions and duplicationswere identified using either the standard 18 exon multiplex PCR (mPCR) orthe MLPA method while Enzymatic Cleavage Mismatch Analysis protocol(Vogiatzakis et al, 2007; 2010) followed by direct DNA sequencing wasperformed for the detection of point mutations.The deletion boundaries, where not apparent, were further investigated witheither mPCR or MLPA.ResultsThe study revealed 308 alterations comprising 254 exon deletions, 22 exonduplications and 32 point mutations. Several polymorphisms were alsoidentified on the DMD gene, of which 6 single nucleotide alterations remainstill under investigation regarding their possible pathogenic character.Although the majority of the mutations were detected along the DMD genehotspot regions (as mentioned in literature), minor discrepancies were notedconcerning the boundaries of the exons’ deletions.Conclusions1. A non-random distribution concerning a high incidence of deletions in thedistal hot spot (exons 45-55) and duplications in exons 2-8 was noticed and isconsistent with the results reported for previous large cohorts (Tuffery-Giraud S et al, 2009, Aartsma-Rus A et al, 2006). Among the 32 pointmutations disclosed, a rather high detection rate was noted in exons 21 and66 having 3 different mutations each. 2. This study revealed 31 point mutations on the DMD gene. Specifically, 37%frameshift mutation 17% splice site mutation and 46% stop codon mutation.All the results are in accordace to the international literature.3.Mutations in the DMD gene should be studied even in individuals withchronic subclinical CK elevations such as DMD carriers4.It should be noted that 251 of the patients (males and females) werereferred solely due to minor BMD-like phenotypic symptoms such ashyperCKemia thus explaining the reduced (47%) detection rate amongreferrals.Εισαγωγή Η ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο της δυστροφίνης έχει αποδειχθεί ιδιαίτερα απαιτητική κυρίως λόγω του μεγάλου μεγέθους του γονιδίου (79 εξόνια, 2,4Kb). Παρόλο που έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία «θερμές περιοχές» (Hot Spot) όπου συσσωρεύονται ελλείψεις και διπλασιασμοί εξονίων, δεν έχει αναφερθεί ένα ανάλογο σημείο συσσώρευσης σημειακών μεταλλάξεων οι οποίες απαντώνται διάσπαρτες καθ όλο το μήκος του γονιδίου. Μεθοδολογία. Στην μελέτη αυτή παρουσιάζονται τα αποτελέσματα του ελέγχου 647 ασθενών (608 άρρενα άτομα και 37 θήλεα) που παραπέμφθηκαν στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του Πανεπιστημίου Αθηνών τις δυο τελευταίες δεκαετίες για έλεγχο για δυστροφινοπάθειες. Οι ελλείψεις και οι διπλασιασμοί εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας το κλασικό πολλαπλό PCR 18 εξονίων αλλά και την τεχνική πολλαπλής ενίσχυσης υβριδοποιημένων ανιχνευτών με το ένζυμο της λιγάσης (Multiplex Ligation –dependant Probe Amplification, MLPA). Οι σημειακές μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σάρωσης ECMA (EnzymaticCleavage Mismatch Analysis protocol (Vogiatzakis et al, 2007; 2010) η οποία τιτλοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής αρχικά για τις ανάγκες της παρούσας μελέτης. Οι σημειακές μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση της πρωτοταγούς δομής του DNA (Direct DNA sequencing). Τα όριατων μεταλλάξεων (όπου δεν ήταν προφανή) μελετήθηκαν περαιτέρω με πολλαπλό PCR ή MLPA. Για την σύγκριση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε η τράπεζα μεταλλάξεων για το γονίδιο DMD του πανεπιστημίου του Leiden,Ολλανδία (www.dmd.nl).Αποτελέσματα. Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε συνολικά 308 μεταλλάξεις και ειδικότερα 254 ήταν ελλείψεις εξονίων, 24 διπλασιασμοί και 32 σημειακές μεταλλάξεις. Επίσης ταυτοποιήθηκαν αρκετοί πολυμορφισμοί του γονιδίου της δυστροφίνης από τους οποίους 6 χρήζουν περαιτέρω μελέτης λόγω της αμφίβολης παθογένειας τους. Παρόλο που η πλειοψηφία των μεταλλάξεων που βρέθηκαν εντοπίζονται στα γνωστά «θερμά σημεία» του γονιδίου παρατηρήθηκαν διαφορές στα όρια των μεταλλάξεων σε σχέση με τα αναφερόμενα στην διεθνή βιβλιογραφία. Συμπεράσματα. 1. Παρατηρήθηκε μη τυχαία κατανομή μεγάλου αριθμού ελλείψεων στο κεντρομερικό «θερμό σημείο» (εξόνια 45-55) καθώς επίσης και μεγάλου αριθμού διπλασιασμών στο αμινοτελικό «θερμό σημείο» (εξόνια 2-8). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με την διεθνή βιβλιογραφία, (Tuffery-GiraudS et al, 2009, Aartsma-Rus A et al, 2006). Ανάμεσα στις 32 σημειακές μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν, παρατηρήθηκε συσσώρευση μεταλλάξεων στα εξόνια 21 και 66, όπου με τρείς διαφορετικές μεταλλάξεις στο κάθε ένα.2. Κατά την διάρκεια της μελέτης αποκαλύφθηκαν 31 σημειακές μεταλλάξεις του γονιδίου της δυστροφίνης σε ασθενείς με μυϊκή δυστροφία Duchenne Becker. Συγκεκριμένα, 37% των μεταλλάξεων ήταν μεταλλάξεις αλλαγής πλαισίου ανάγνωσης, 17% ήταν μεταλλάξεις σε σημεία ματίσματος και 46% μεταλλάξεις που προκαλούν πρόωρο κωδικόνιο λήξεις. Τα αποτελέσματα της μελέτης συμφωνούν και με την διεθνή βιβλιογραφία παρόλο που ο αριθμός των ασθενών δεν ήταν ικανός για να διευκρινιστεί το ποσοστό των σημειακών μεταλλάξεων σε ασθενείς με Duchenne, και Beckerξεχωριστά.3. Απαιτείται η μελέτη των μεταλλάξεων στο γονίδιο της δυστροφίνης ακόμα και στις περιπτώσεις ασθενών που εμφανίζουν απλά υποκλινικά συμπτώματα(όπως αυξημένα CPK) καθώς και σε περιπτώσεις φορέων της νόσου.4. Η δυσκολία μοριακής επιβεβαίωσης πολλών νευρομυικών παθήσεων οδηγεί στην παραπομπή για έλεγχο του γονιδίου DMD περιστατικών όπου ηδυστροφινοπάθεια αποτελεί διαφορική διάγνωση. Ως εκ τούτου πολλοί ασθενείς παραπέμπονται χωρίς να έχουν την τυπική κλινική εικόνα δυστροφινοπάθειας (αρκετές παραπομπές έχουν γίνει με μοναδικό εύρημα αυξημένα CPK στο αίμα) γεγονός που ερμηνεύει το μειωμένο ποσοστό διάγνωσης στην παρούσα μελέτη

SURVEYOR on the Spot: Strengths and Weaknesses in Molecular Diagnostics

This correspondence addresses J Mol Diagn 2009, 11:311–318, on the advantages and disadvantages of using SURVEYOR in molecular diagnostic mutation detection

Serum Angiopoietin-2 and CRP Levels During COPD Exacerbations

Background and Objective: Angiopoietin-2 (Ang-2) is an important mediator of angiogenesis and has been implicated in many inflammatory diseases. COPD is characterized by systemic inflammation, which is enhanced during exacerbations and may be assessed by measuring serum C-reactive protein (CRP). The aim of the study was to evaluate serum CRP and Ang-2 levels on the first (D1) and seventh day (D7) of hospitalization due to a COPD exacerbation and to examine possible associations of CRP and Ang-2 levels and kinetics with the length of hospital stay and outcome. Methods: We conducted a prospective study and evaluated 90 patients admitted to the hospital with a diagnosis of an acute exacerbation of COPD. A venous blood sample was obtained from all patients on D1 and D7 of hospitalization, for the measurement of Ang-2 and CRP. Results: Serum Ang-2 levels were significantly higher on D1 compared to D7 during the course of COPD exacerbation (p < 0.001). Serum CRP levels were also significantly higher on D1 compared to D7 (p < 0.001). Serum Ang-2 presented a significant positive correlation with CRP levels both on D1 and D7 (r = 0.315 and r = 0.228, respectively). Patients with unfavorable outcome had significantly higher Ang-2 levels both on D1 (p = 0.04) and D7 (p = 0.01). Conclusions: Serum Ang-2 levels are elevated at the onset of COPD exacerbations and are positively associated with CRP levels. Ang-2 levels decrease during the course of COPD exacerbations in patients with favorable outcome. Serum Ang-2 may serve as a biomarker that could predict the outcome of a COPD exacerbation

Retrospective analysis of persistent HyperCKemia with or without muscle weakness in a case series from Greece highlights vast <i>DMD</i> variants’ heterogeneity

Persistent hyperCKemia results from muscle dysfunction often attributed to genetic alterations of muscle-related genes, such as the dystrophin gene (DMD). Retrospective assessment of findings from DMD analysis, in association with persistent HyperCKemia, was conducted. Evaluation of medical records from 1354 unrelated cases referred during the period 1996–2021. Assessment of data concerning the detection of DMD gene rearrangements and nucleotide variants. A total of 730 individuals (657 cases, 569 of Greek and 88 of Albanian origins) were identified, allowing an overall estimation of dystrophinopathy incidence at ~1:3800 live male births. The heterogeneous spectrum of 275 distinct DMD alterations comprised exon(s) deletions/duplications, nucleotide variants, and rare events, such as chromosome translocation {t(X;20)}, contiguous gene deletions, and a fused gene involving the DMD and the DOCK8 genes. Ethnic-specific findings include a common founder variant in exon 36 (‘Hellenic’ variant). Some 50% of hyperCKemia cases were characterized as dystrophinopathies, highlighting that DMD variants may be considered the most common cause of hyperCKemia in Greece. Delineation of the broad genetic and clinical heterogeneity is fundamental for actionable public health decisions and theragnosis, as well as the establishment of guidelines addressing ethical considerations, especially related to the mild asymptomatic patient subgroup.</p