Haplotype diversity patterns in Quercus suber (Fagaceae) inferred from cpDNA sequence data

Chloroplast genome diversity in cork oak (Quercus suber) is characterised by the occurrence of haplotypes that are akin to those found in other Mediterranean oak species, particularly in Q. ilex and Q. rotundifolia, suggesting the possible presence of an introgressed chloroplast lineage. To further investigate this pattern, we reconstructed chloroplast haplotypes by sequencing four chloroplast markers (cpDNA), sampled across 181 individuals and 10 taxa. Our analyses resulted in the identification of two diversified chloroplast haplogroups in Q. suber, corresponding to a geographically widespread lineage and an Afro-Iberian lineage. Time-calibrated phylogenetic analyses of cpDNA point to a Miocene origin of the two haplogroups in Q. suber, suggesting that the Afro-Iberian lineage was present in cork oak before the onset of glaciation periods. The persistence of the two haplogroups in the western part of the species distribution range may be a consequence of either ancient introgression events or chloroplast lineage sorting, combined with different fixation in refugia through glaciation periods. Our results provide a comprehensive insight on the origins of chloroplast diversity in these ecologically and economically important Mediterranean oaks.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Haplotype diversity patterns in Quercus suber (Fagaceae) inferred from cpDNA sequence data

Chloroplast genome diversity in cork oak (Quercus suber) is characterised by the occurrence of haplotypes that are akin to those found in other Mediterranean oak species, particularly in Q. ilex and Q. rotundifolia, suggesting the possible presence of an introgressed chloroplast lineage. To further investigate this pattern, we reconstructed chloroplast haplotypes by sequencing four chloroplast markers (cpDNA), sampled across 181 individuals and 10 taxa. Our analyses resulted in the identification of two diversified chloroplast haplogroups in Q. suber, corresponding to a geographically widespread lineage and an Afro-Iberian lineage. Time-calibrated phylogenetic analyses of cpDNA point to a Miocene origin of the two haplogroups in Q. suber, suggesting that the Afro-Iberian lineage was present in cork oak before the onset of glaciation periods. The persistence of the two haplogroups in the western part of the species distribution range may be a consequence of either ancient introgression events or chloroplast lineage sorting, combined with different fixation in refugia through glaciation periods. Our results provide a comprehensive insight on the origins of chloroplast diversity in these ecologically and economically important Mediterranean oaks.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Establishment of neural circuits during zebrafish development: characterization and optimization of imaging conditions

Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020O peixe-zebra (Danio rerio) é um peixe de água doce da família dos ciprinídeos. Em neurociência, o uso do peixe-zebra como modelo tem vindo a aumentar, pois este apresenta um padrão anatómico e circuitos neuronais semelhantes à maioria dos vertebrados. Para além disso, a sua transparência natural em estados lavares permite a imagiologia do cérebro in vivo. Devido à sua corrente popularidade, existem várias ferramentas genéticas disponíveis que permitem a criação de linhas transgénicas estáveis. No peixe-zebra, o desenvolvimento do cérebro ocorre num curto período de tempo. A neurogénese inicia-se por volta das 10 horas após fertilização (hpf), ainda durante a gastrulação. Nesta etapa forma-se um modelo primário da rede neuronal. A axogénese destes neurónios inicia-se entre as 14 e 24 hpf. A neurogénese secundária, expande a rede neuronal primária, não existindo separação temporal clara entre as duas fases. Durante o 1º dpf o tubo neural é formado e sofre morfogénese regional criando 10 neurómeros entre o prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo. Esta regionalização (rostro-caudal e dorso-ventral) contribui para o desenvolvimento dos vários subtipos de neurónios e células gliais uma vez que fornece gradientes de fatores parácrinos e sinais celulares. Assim, no final do 1º dpf, os embriões já apresentam contrações musculares espontâneas, ao 2º dia de desenvolvimento os embriões respondem ao toque e no final da primeira semana de desenvolvimento, as larvas exibem um conjunto de comportamentos inatos, entre os quais os comportamentos visualmente-guiados. Os comportamentos visualmente-guiados são comportamentos exibidos naturalmente pelas larvas do peixe-zebra e podem ser controlados em laboratório. A resposta optocinética é um movimento reflexivo do olho que permite que o organismo siga um estímulo rotativo. A resposta optomotora é uma adaptação do comportamento natatório a uma mudança percecionada no movimento da água. Para compreender como o cérebro controla estes comportamentos é importante identificar os circuitos que estão por detrás destes e isto é possível com a criação de linhas transgénicas. As linhas transgénicas aqui referidas foram geradas pelo Orger Lab (Fundação Champalimaud – Centre for the Unknown) através da introdução por transgénese mediada por transposão de um fragmento genético de peixe-zebra. O fragmento genético introduzido contém um gene de interesse, que se sabe previamente que tem expressão em certas populações neuronais. Associado ao primeiro codão deste gene de interesse está o GFF (derivado de Gal4). Por cruzamento destas linhas transgénicas com uma linha UAS:GFP, é possível exprimir o repórter (GFP – Green Fluorescent Protein) nas populações neuronais onde o gene de interesse é naturalmente expresso. Após imagiologia, é necessário atribuir a cada estrutura uma região cerebral num processo chamado de caracterização anatómica. Neste momento, vários atlas digitais e bases de dados do cérebro do peixe-zebra têm sido desenvolvidos para o estádio de 6 dpf, como o Z-Brain, Zebrafish Brain Browser e o Mas-Planck Zebrafish Brain Atlas. No entanto, para estádios mais precoces de desenvolvimento, apenas tentativas parciais foram realizadas. Desta forma, os objetivos desta dissertação são: caracterizar anatomicamente duas linhas transgénicas (Tg(Pitx2c:GFF) e TgBAC(sst1:GFF) geradas pelo Orger Lab) e explorar marcações de contraste e posições de montagem adequadas para o estudo dos estágios de desenvolvimento precoces em peixe-zebra. As imagens da caracterização anatómica foram adquiridas através de microscopia confocal após um tratamento imunohistoquímico e de seguida submetidas a análise de imagem e caracterização anatómica. Por comparação visual com bibliografia, atlas e bases de dados previamente descritos, a caracterização anatómica foi efetuada, identificando estruturas cerebrais no prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo. Na caracterização anatómica, ambas as linhas mostraram expressão de GFP desde o 1º dpf até ao 6º dpf. Nos primeiros dias de desenvolvimento a expressão é, no geral, mais fraca, sendo que a sua distribuição espacial e nível de expressão aumentam com o passar do tempo. O padrão de expressão de GFP parece ser estabelecido em torno do 3º e 4º dpf. Após estes estágios, o padrão espacial mantém-se verificando-se apenas o crescimento em número de células até aos 6 dpf. O gene Pitx2c codifica um fator de transcrição. A linha Tg(Pitx2c:GFF) tem expressão de GFP em regiões cujo gene – Pitx2c – já tinha mostrado expressão prévia. Entre as quais, destaca-se a assimetria encontrada no diencéfalo (mais propriamente no epitálamo), a expressão no núcleo do fascículo longitudinal medial (nMLF), no núcleo oculomotor e na retina. Todas estas estruturas anatómicas estão envolvidas nos circuitos que formam os comportamentos de resposta optocinética e optomotora. O gene sst1 codifica o neurotransmissor de somatostatina. A linha TgBAC(sst1:GFF) também apresenta expressão em estruturas previamente descritas com expressão do gene, como o cerebelo. Outras regiões, como epitálamo, pálio, sub-pálio e núcleo interpeduncular também foram aqui verificadas. Estas estruturas, encontram-se associadas às redes neuronais que levam aos comportamentos visualmente-guiados. Devido ao facto dos atlas e bases de dados do cérebro do peixe-zebra se focarem sobretudo em estádios de desenvolvimento mais avançados, não existe ainda um protocolo otimizado para a imagiologia destas amostras quer em termos de marcação de contraste, quer em termos de montagem entre lâmina e lamela. Aqui, tentou-se explorar algumas alternativas a estes casos. O tERK é um anticorpo usado por vários atlas digitais como marcação de contraste. Contudo, e apesar de ser uma boa marcação para estádios mais avançados de desenvolvimento (como os 6 dpf), o seu desempenho não é tão favorável para estádios mais precoces (como os 2 dpf). Deste modo, alternativas que possam ser usadas para todos os estádios de desenvolvimento são necessárias. Aqui explorámos vários tipos de marcadores de contraste: mScarlet (uma proteína fluorescente associada ao promotor da α-tubulina, na linha transgénica: alphatubulin:mScarlet), DiD (um corante lipídico que marca membranas celulares) e BODIPY TR methyl ester (um corante que marca membranas de organelos celulares). Em relação às marcações de contraste alternativas à marcação por tERK (anticorpo), alphatubulin:mScarlet parece ser uma potencial alternativa, uma vez que permite a marcação desde estágios precoces de desenvolvimento até estágios mais avançados e também permite não só a imagiologia de tecido fixo como também permite a imagiologia in vivo. DiD, também apresenta algumas vantagens em relação ao tERK, podendo ser tido como alternativa a este. O BODIPY TR, pelo contrário, não parece ser uma alternativa adequada. Em termos de posicionamento durante a montagem dos embriões para imagiologia, experimentaram-se duas orientações diferentes: horizontal (convencional) e vertical (alternativa). Isto, porque o cérebro dos embriões de peixe-zebra apresenta uma curvatura que faz com que haja estruturas que fiquem menos acessíveis à imagiologia. Ambas as posições permitiram a imagiologia de grande parte do cérebro, podendo ser alternadas dependendo das estruturas que se pretende estudar. Ainda em relação à imagiologia dos cérebros de estádios precoces de desenvolvimento, usou-se a microscopia confocal e de light sheet. A microscopia confocal apresenta uma resolução elevada que permite o estudo detalhado das estruturas cerebrais, enquanto que a microscopia de light sheet permite a rotação da amostra dentro do microscópio permitindo a imagiologia a partir de vários ângulos, para uma mesma amostra. Em suma, através da caracterização anatómica e da exploração de alternativas para estádios de desenvolvimento precoces, tencionou-se contribuir em parte para o enriquecimento das bases de dados já existentes com a caracterização de duas novas linhas transgénicas e em parte para a melhoria da imagiologia do cérebro precoce dos embriões de peixe-zebra. Isto, tendo em conta o objetivo geral do laboratório (Orger Lab) de construir atlas anatómicos digitais para os vários estádios de desenvolvimento e para cada linha transgénica.The use of the zebrafish (Danio rerio) as a model in neuroscience has been growing since it presents a similar anatomic pattern and neuronal circuitries to most vertebrates. In zebrafish, development occurs in a short period of time: neurogenesis starts during gastrulation. At the end of the 1st day post fertilization (dpf), embryos already exhibit spontaneous muscular contractions and within one week of development, larvae display a set of innate behaviors, such as the visually guided behaviors. The visually guided behaviors are naturally performed and easily controlled in the laboratory, making these easier to study and understand the neuronal circuits behind them. Additionally, the expansion of the genetic tools available has been favorable to the construction of new transgenic lines that allows the identification and imaging of neuronal populations of these networks. After identifying these populations, it is necessary to assign brain regions to each structure with the aim to build a comprehensive atlas through development. Several atlases and databases of the zebrafish brain have been created for the 6 dpf stage, but for early stages only partially attempts have been done. Here we address the anatomical characterization of two GFP-expressing reporter lines – Tg(Pitx2c:GFF) and the TgBAC(sst1:GFF) – with the long-term goal of creating a 3D digital atlas from the 1st dpf to the 6th dpf. These images were acquired by confocal microscopy after immunohistochemistry. Then they were submitted to image analysis. Through visual comparison with previously described bibliography and atlases, anatomical characterization of our images was done, identifying brain structures in the prosencephalon, mesencephalon and rhombencephalon. Furthermore, we explored counter staining alternatives to tERK antibody – contrast staining – such as the mScarlet, DiD and BODIPY TR and also new mounting methods as well as imaging alternatives for the whole brain in early stages, with the aim of contributing to zebrafish digital atlases and databases