РОЛЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ В РЕДОКС-РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ КАСПАЗЫ-3 В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ IN VITRO

The formation of oxidative stress lies at the heart of many frequent and socially-important diseases. Blood lymphocytes are the cells which provide immunological control of our organism. As a result of their function implementation blood lymphocytes contact with different endogenic and exogenic factors, which can lead to active oxygen species production activation, macromolecules oxidative modification and to cell survival alteration. At the present time it is essential to expand and deepen the fundamental knowledge of blood lymphocytes apoptosis regulation peculiarities. The research objective was to establish the interaction among alterations of glutathione system condition, carbonylation level, protein glutathionylation and caspase-3 activity in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro.Material and Methods. The material for research was blood lymphocytes cultivated with addition of hydrogen peroxide in final concentration of 0,5 mmol and/or protein SH-group inhibitor N-ethylmaleimide – 5 mmol, protector – 5 mmol – 1,4-dithioerythritol. Reduced, oxidized and protein-bound glutathione concentration was measured by method of spectropho-tometry, additionally, the ratio size of reduced to oxidized thiol fraction was estimated. With help of enzymoimmunoassay the level of protein carbonyl derivatives was evaluated; caspase-3 activity was registered by spectrofluorometric method.Results. Protein SH-group blocking in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro was accompanied by protein-bound glutathione concentration rapid decrease in connection with increase of protein carbonyl derivatives content and caspase-3 activity. Protein SH-group protection in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro was accompanied by concentration increase of protein-bound glutathione and protein carbonyl derivatives under comparable values of enzyme activity under study.Conclusion. The carried out research shows that caspase-3 and protein-bound glutathione are the molecular targets of selective control over programmed cell death. The received indices of caspase-3 activity change and protein-bound glutathione concentration alteration in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro can be used when elaborating target therapy approaches to diseases accompanied by apoptosis disregulation.В основе патогенеза многих распространенных и социально-значимых заболеваний лежит формирование окислительного стресса. Лимфоциты крови являются клетками, обеспечивающими иммунологический контроль организма. В результате происходит контакт лимфоцитов крови с различными эндогенными и экзогенными факторами, что может приводить к интенсификации продукции активных форм кислорода, окислительной модификации макромолекул и изменению выживаемости клеток. Актуальным является расширение и углубление фундаментальных знаний об особенностях регуляции апоптоза лимфоцитов крови.Цель исследования – установить взаимосвязь между изменением состояния системы глутатиона, уровнем карбонилирования, глутатионилирования белков и активностью каспазы-3 в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro.Материалы и методы. Материалом для исследования служили лимфоциты крови, культивированные с добавлением пероксида водорода в конечной концентрации 0,5 ммоль и (или) блокатора SH-групп протеинов N-этилмалеимида – 5 ммоль, протектора – 5 ммоль – 1,4-дитиоэритритола. Методом спектрофотометрии определяли концентрацию восстановленного, окисленного и белковосвязанного глутатиона, дополнительно рассчитывали величину соотношения восстановленной фракции тиола к окисленной. С помощью иммуно-ферментного анализа оценивали уровень карбонильных производных протеинов, активность каспазы-3 регистрировали спектрофлюориметрическим методом.Результаты. Блокирование SH-групп протеинов в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro сопровождалось резким падением концентрации белково-связанного глутатиона на фоне увеличения содержания карбонильных производных белков и активности каспазы-3. Протекция SH-групп белков в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro сопровождалась возрастанием концентрации белково-связанного глутатиона, карбонильных производных протеинов при сопоставимых значениях активности изучаемого фермента.Выводы. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что каспаза-3 и белково-связанный глутатион являются молекулярными мишенями селективного управления программированной клеточной гибелью. Полученные показатели изменения активности каспазы-3 и концентрации белково-связанного глутатиона в лимфоцитах крови при окислительном стрессе in vitro могут быть использованы при разработке подходов таргетной терапии заболеваний, сопровождающихся дисрегуляцией апоптоза

НАРУШЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МРНК HSP27 И УБИКВИТИНА КАК МЕХАНИЗМ УСКОЛЬЗАНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ JURKAT ОТ АПОПТОЗА

The research objective is to establish the link between heat shock protein 27 and ubiquitin mRNA expression as well as Jukart tumor cell apoptosis.The method of flow cytofluorometry has been used to evaluate apoptosis realization using FITC-labeled annexin V and propidium iodide along with the amount of reactive oxygen species. Spectrofluorimetry has been applied to register the caspase-3 activity. The content of hydroxyl radicals has been determined by spectrophotometry. The level of ubiquitin and heat shock protein 27 mRNA expression has been identified using real-time PCR. Intact Jukart tumor cells and blood lymphocytes of healthy donors served the material for the research.Following the carried out research it has been found out that the fall in the amount of annexin V positive cells and the reduced caspase-3 activity were accompanied by the rise in the content of hydroxyl radicals and reactive oxygen species against the backdrop of the increased heat shock protein 27 and ubiquitin mRNA expression in Jukart tumor cells.Цель исследования – установить взаимосвязь между экспрессией мРНК белка теплового шока 27, убиквитина и реализацией апоптоза в опухолевых клетках линии Jurkat.Методом проточной цитофлюориметрии проводили оценку реализации апоптоза с использованием FITS-меченного аннексина V и пропидия иодида, количества активных форм кислорода, спектро¬флюориметрическим методом регистрировали активность каспазы-3. Содержание гидроксильного радикала определяли спектрофотометрическим методом. Уровень экспрессии мРНК убиквитина и белка теплового шока 27 – с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. Материалом для исследования служили интактные опухолевые клетки линии Jurkat и лимфоциты крови здоровых доноров.В результате проведенного исследования установлено, что снижение количества аннексин-положительных клеток и активности каспазы-3 сопровождалось увеличением содержания гидроксильного радикала и активных форм кислорода на фоне усиления экспрессии мРНК белка теплового шока 27 и убиквитина в опухолевых клетках линии Jurkat

СИСТЕМА ГЛУТАТИОНА УЧАСТВУЕТ В РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

The research objective is to determine the role of the gluthatione system components in realization of the receptor pathway of Jukart tumor cell apoptosis.Apoptosis realization using FITC-labeled annexin V and propidium iodide as well as the amount of TNF R1- and Fas-presenting cells has been evaluated by flow cytofluorometry; activity caspase-3 registered a spektroflyuorimetrichesky method. The concentration of reduced and oxidated gluthatione has been determined by spectrophotometry.The material for the research was intact Jukart tumor cells and the ones incubated in the presence of a selective inhibitor of the key gluthatione synthesis enzyme – buthionine-sulfoximine.The research has shown that the gluthatione system plays an important regulatory role in activation of the receptor pathway of Jukart tumor cell apoptosis.The gluthatione system components are targets for activation of programmed cell death in tumor growth.Цель исследования – выявить роль компонентов системы глутатиона в реализации рецепторного пути апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat.Оценку реализации апоптоза проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием FITS-меченного аннексина V и пропидия иодида, количества TNF R1- и Fas-презентирующих клеток; активность каспазы-3 регистрировали спектрофлюориметрическим методом. Определение содержания восстановленного и окисленного глутатиона осуществляли спектрофотометрическим методом.Материалом для исследования служили опухолевые клетки линии Jurkat: интактные и инкубированные в присутствии селективного ингибитора ключевого фермента синтеза глутатиона – бутионин-сульфоксимина.Исследование показало, что система глутатиона играет важную регуляторную роль в активации рецепторного пути апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat.Компоненты системы глутатиона являются мишенями для активации программированной гибели при опухолевом росте

THE ROLE OF PROTEIN OXIDATIVE MODIFICATION IN REDOX-REGULATION OF CASPASE-3 ACTIVITY IN BLOOD LYMPHOCYTES DURING OXIDATIVE STRESS IN VITRO

The formation of oxidative stress lies at the heart of many frequent and socially-important diseases. Blood lymphocytes are the cells which provide immunological control of our organism. As a result of their function implementation blood lymphocytes contact with different endogenic and exogenic factors, which can lead to active oxygen species production activation, macromolecules oxidative modification and to cell survival alteration. At the present time it is essential to expand and deepen the fundamental knowledge of blood lymphocytes apoptosis regulation peculiarities. The research objective was to establish the interaction among alterations of glutathione system condition, carbonylation level, protein glutathionylation and caspase-3 activity in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro.Material and Methods. The material for research was blood lymphocytes cultivated with addition of hydrogen peroxide in final concentration of 0,5 mmol and/or protein SH-group inhibitor N-ethylmaleimide – 5 mmol, protector – 5 mmol – 1,4-dithioerythritol. Reduced, oxidized and protein-bound glutathione concentration was measured by method of spectropho-tometry, additionally, the ratio size of reduced to oxidized thiol fraction was estimated. With help of enzymoimmunoassay the level of protein carbonyl derivatives was evaluated; caspase-3 activity was registered by spectrofluorometric method.Results. Protein SH-group blocking in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro was accompanied by protein-bound glutathione concentration rapid decrease in connection with increase of protein carbonyl derivatives content and caspase-3 activity. Protein SH-group protection in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro was accompanied by concentration increase of protein-bound glutathione and protein carbonyl derivatives under comparable values of enzyme activity under study.Conclusion. The carried out research shows that caspase-3 and protein-bound glutathione are the molecular targets of selective control over programmed cell death. The received indices of caspase-3 activity change and protein-bound glutathione concentration alteration in blood lymphocytes during oxidative stress in vitro can be used when elaborating target therapy approaches to diseases accompanied by apoptosis disregulation

Пептидергічна регуляція ниркових функцій

The paper discusses the topical research problem of the mechanisms of a peptidergic regulation of the renal function, involving the natural peptide complex derived from the renal cortical substance (RCS). It has been demonstrated that the RCS manifests tissue specifity, the ability to affect the renal functional status – the processes of filtration, reabsorption and secretion under physiological conditions and under the modulation of secretion and reabsorption by physiologically active substances; the ability to affect biochemical reactions, hemocoagulation, DNA biosynthesis. The following interaction with cells of the immune system has been determined for RCS: the ability to modulate the activity of peripheral blood lymphocytes (mainly T-cells); to induce morphofunctional restructuring in the thymus; to restore the natural state of immunological tolerance in the organism of laboratory animals to a mixture of tissue antigens; to alter the surface expression of antigenic determinants of lymphocytes and mannose-containing membrane structures; to influence on the apoptosis of lymphocytes and thymocytes. The physiological activity of the RCS pertaining to the indices of the peripheral blood and liver functions has been evaluated. The effect of synthetic peptide-analogues of the RCS (PEKDLRK, PEKDSRK, PEKDDRL) has been synthesized and investigated. The obtained results confirm the existence of a local peptide regulation system in the kidneys which is implemented through the formation of low molecular weight peptide substances and affects physiological processes not only in the kidneys, but also in other organs and systems. A wide range of the physiological activity of the RCS and synthetic peptides created on its basis are indicative of the prospects of their further research in order to develop effective medications for renal pathology.Работа посвящена актуальной проблеме исследования механизмов пептидэргической регуляции функции почек при участии природного пептидного комплекса, полученного из коркового вещества почек (ПКП). Показано, что ПКП обладает тканеспецифичностью, способностью влиять на функциональное состояние почек – на процессы фильтрации, реабсорбции и секреции при физиологических условиях и при модуляции секреции и реабсорбции физиологически активными веществами; влиять на состояние биохимических реакций, гемокоагуляцию, биосинтез ДНК. Для ПКП определено взаимодействие с клетками иммунной системы - способность модулировать активность лимфоцитов периферической крови (преимущественно Т-клеток), вызывать морфофункциональную перестройку в тимусе, восстанавливать состояние природной иммунологической толерантности организма лабораторных животных к смеси тканевых антигенов, изменять экспрессию поверхностных антигенных детерминант лимфоцитов и маннозосодержащих мембранных структур, влиять на процессы апоптоза лимфоцитов и тимоцитов. Определено физиологическую активность ПКП относительно показателей периферической крови и печеночных функций. Синтезировано и исследовано влияние синтетических пептидов-аналогов ПКП – PEKDLRK, PEKDSRK, PEKDDRL. Результаты работы подтверждают существование в почках локальной системы пептидной регуляции, которая реализуется путем образования низкомолекулярных пептидных веществ и влияет на физиологические процессы не только в почках, но и в других органах и системах. Широкий спектр физиологической активности ПКП и синтетических пептидов, созданных на его основе, свидетельствуют о перспективности дальнейшего их исследования с целью разработки эффективных лекарственных средств при почечной патологии.Робота присвячена актуальній проблемі дослідження механізмів пептидергічної регуляції функції нирок за участю природного пептидного комплексу (ПКН), отриманого із кіркової речовини нирок. Показано, що ПКН володіє тканиноспецифічністю, здатністю впливати на функціональний стан нирок – на процеси фільтрації, реабсорбції та секреції за фізіологічних умов і при модуляції секреції та реабсорбції фізіологічно активними речовинами; впливати на стан біохімічних реакцій, гемокоагуляцію, біосинтез ДНК. Для ПКН визначено взаємодію з клітинами імунної системи – здатність модулювати активність лімфоцитів периферичної крові (переважно Т-клітин), викликати морфофункціональну перебудову в тимусі, відновлювати стан природної імунологічної толерантності організму лабораторних тварин до суміші тканинних антигенів, змінювати експресію поверхневих антигенних детермінант лімфоцитів та манозомісних мембранних структур, впливати на процеси апоптозу лімфоцитів та тимоцитів. Визначено фізіологічну активність ПКН стосовно показників периферичної крові та печінкових функцій. Синтезовано та досліджено вплив штучних пептидіваналогів ПКН – PEKDLRK, PEKDSRK, PEKDDRL. Результати роботи підтверджують існування в нирках локальної системи пептидної регуляції, яка реалізується шляхом утворення низькомолекулярних пептидних речовин та впливає на фізіологічні процеси не тільки в нирках, але й в інших органах та системах. Широкий спектр фізіологічної активності ПКН та синтетичних пептидів, створених на його основі, свідчить про перспективність подальшого їх дослідження з метою розробки ефективних лікарських засобів при нирковій патології