Hepatitis C virus epidemiology and evolution of genotype 5a

Het hepatitis C virus (HCV) is over de ganse wereld één van de belangrij kste oorzaken van chronisch leverlijden. Het virus werd ontdekt in 1989, en heeft momenteel wereldwijd al minstens 170 miljoen geïnfecteerden ac hter zijn naam staan. Taxonomisch wordt dit virus ingedeeld bij de famil ie van de Flaviviridae, waar het samen met GB virus C in het genus Hepac ivirussen geclassificeerd wordt. Het genoom van HCV vertoont heel wat variabiliteit, en dit heeft geleid tot het ontstaan van minstens zes ve rschillende HCV genotypen. Deze genotypen hebben een typische geografisc he verdeling, en zijn verder onderverdeeld in meerdere subtypen. Sommige HCV genotypen, zoals HCV genotypen 1a, 1b en 3a, zijn wereldwijd verspr eid en vertonen een beperkte hoeveelheid genetische diversiteit. Transmi ssienetwerken door intraveneus druggebruik en bloedtransfusies zijn hoog stwaarschijnlijk verantwoordelijk voor de snelle, wereldwijde verspreidi ng van de epidemische stammen. Andere HCV genotypen worden dan weer geka rakteriseerd door een extreem hoog niveau van diversiteit met een bijhor end groot aantal subtypes. Deze stammen zijn relatief beperkt in geograf ische verspreiding. Voorbeelden zijn HCV genotype 2 in West Afrika, HCV genotype 4 in Centraal Afrika, en HCV genotypen 3 en 6 in Zuidoost Azië. Op basis van de geobserveerde diversiteit wordt aangenomen dat deze end emische stammen al honderden jaren circuleren in hun respectieve geograf ische populaties. In tegenstelling tot andere HCV genotypen, is er heel weinig geweten over de evolutie en verspreiding van HCV genotype 5a. Dit genotype werd voor het eerst gerapporteerd in Zuid-Afrika, waar het met een ook het meest voorkomende HCV genotype is. Echter, de laatste jaren zijn er kleinere clusters van dit ongewone genotype gerapporteerd over d e hele wereld, o.a in Frankrijk, Spanje, Syrië, Verenigd Koninkrijk, Ned erland en Canada. Ook in België, meer bepaald in West-Vlaanderen, werd e en ongewoon hoge prevalentie van dit HCV genotype opgemerkt. In deze thesis probeerden we een antwoord te formuleren op de bestaande vragen omtrent de oorsprong, evolutie en verspreiding van dit ongewone H CV genotype. Omdat HCV genotype 5a stalen schaars zijn, wilden we eerst nagaan of de commerciële genotyperingskits die gebruikt worden op ons la boratorium in staat zijn de HCV genotype 5a stammen correct te identific eren. In hoofstuk II werden twee HCV genotyperingskits geëvalueerd: de V ERSANT HCV Genotyping Assay (LiPA) 1.0 en de VERSANT HCV Genotyping Assa y (LiPA) 2.0. De accuraatheid van de LiPA 1.0 werd nagekeken voor 77 Bel gische en Zuid-Afrikaanse HCV genotype 5a stalen. Een phylogenetische an alyse van de NS3-NS4 regio van het HCV genoom werd gebruikt om het genot ype van de stalen te bevestigen. We stelden een concordantie van 100% va st tussen de resultaten verkregen met de LiPA 1.0 en de genotypering geb aseerd op de fylogenetische analyse. Nucleotide sequenering van de 5 -UT R, de genomische regio die door deze assay als doelwit gebruikt wordt vo or binding van de probe, toonde aan dat sequentie heterogeniteit aanwezi g was in sommige stalen. Een mismatch in het midden van de probe-bindend e regio of meerdere mismatchen op het einde van de probe bindende regio interfereren niet met het uiteindelijke resultaat. We kunnen besluiten d at de LiPA 1.0 een accurate methode is om de zeldzame HCV genotype 5a st ammen te identificeren. In een tweede studie hebben we de LiPA 2.0 voor alle circulerende HCV genotypen gevalideerd. Deze assay gebruikt bijkome nde informatie uit de core regio van het HCV genoom om het genotype te b epalen, en zou daarom betere resultaten moeten opleveren. De klinische a ccuraatheid werd nagegaan door 326 HCV positieve stalen te testen waarva n het genotype werd bepaald door fylogenetische analyse van de NS5B regi o (referentie methode). Het HCV genotype kon bepaald worden voor 96% van de stalen. Bij 99.4% kwam het resultaat van de LiPA 2.0 overeen met het resultaat van de referentie methode. Een vergelijkende studie tussen de LiPA 1.0 en de LiPA 2.0 toonde aan dat stalen waarvan het genotype verk eerdelijk werd bepaald door de LiPA 1.0, wel correct konden worden geïnt erpreteerd met de LiPA 2.0. De LiPA 2.0 is dus een accurate, gevoelige e n betrouwbare techniek om HCV genotypen te bepalen. Het toevoegen van de core als probe bindende regio heeft duidelijk een positief effect. Vervolgens hebben we ons onderzoek toegespitst op de oorsprong en de ver spreiding van HCV genotype 5a (hoofdstuk III). Om de moleculaire epidemi ologie van de HCV genotype 5a cluster in West-Vlaanderen te bestuderen, voerden we een fylogenetische analyse uit. Onze resultaten toonden aan d at we twee verschillende clusters kunnen onderscheiden, één gevormd door de Belgische stalen en een tweede met Zuid-Afrikaanse stammen. Deze bev indingen suggereren dat het virus zich onafhankelijk heeft verspreid in twee verschillende regio s. Beide clusters hebben bovendien een vergelij kbare diversiteit. Divergentietijden en demografische parameters werden geschat met behulp van een Bayesiaanse coalescentie analyse. De meest re cente gemeenschappelijke voorouder (MRCA) van de Belgische stammen werd geschat op 1869 [1792-1929] voor de E1-E2 regio en op 1866 [1818-1913] v oor de NS3-NS4 regio. Voor Zuid-Afrika werden volgende data berekend: 18 83 [1821-1934] voor E1-E2 en 1863 [1794-1921] voor NS3-NS4. We toonden t evens aan dat de HCV epidemische geschiedenissen verschillen vertonen in beide geografische regio s. In België zagen we een bijna constante expo nentiële groei. Dit patroon is consistent met transmissie die voornameli jk via bloedtransfusies verloopt. Voor Zuid-Afrika constateerden we een afname in de verspreidingssnelheid naar het heden toe. Dit patroon refle cteert eerder transmissie via andere iatrogene wegen. Onze resultaten he bben een nieuw licht geworpen op de bestaande hypothese rond het ontstaa n van HCV genotype 5a. Er werd jarenlang aangenomen dat de endemische br on van HCV genotype 5a in Zuid-Afrika moet gezocht worden. Maar op basis van onze resultaten is het veel aannemelijker dat de oorsprong van dit genotype elders gelokaliseerd is, en dat het virus vanuit deze gemeensch appelijke bron tegelijkertijd in twee richtingen is verspreid. Een mogel ijke kandidaat is Congo, omdat dit een Belgische kolonie was eind 1800, en omdat er veel verkeer was tussen Congo en Zuid-Afrika in diezelfde pe riode door ontdekkingsreizen in beide gebieden. In hoofdstuk IV bestudee rden we de wereldwijde verspreiding van HCV genotype 5a. Stalen van Belg ië, Zuid-Afrika, Frankrijk, Spanje, Syrië, Nederland, Portugal, Duitslan d, Verenigd Koninkrijk en Luxemburg werden onderworpen aan een phylogene tische analyse. Hierbij demonstreerden we dat de stammen grotendeels clu steren naargelang hun geografische oorsprong. Deze bevinding impliceert dat HCV genotype 5a zich anders gedraagt dan de epidemische genotypen wa arvoor de geografische voetafdrukken al verdwenen zijn door een snelle, wereldwijde verspreiding. Voor Spanje en Syrië werd de epidemische gesch iedenis in detail besproken. De MRCA werd geschat op 1896 [1842-1919] vo or E1-E2 en op 1884 [1864-1924] voor NS3-NS4 van de Spaanse stammen, en op 1903 [1843-1948] voor E1-E2 en 1906 [1884-1924] voor NS3-NS4 van de s tammen uit Syrië. In beide geografische gebieden werd verspreiding van H CV genotype 5a gehandhaafd door iatrogene transmissie. De lokale verspreiding van HCV genotype 5a in Vlaanderen werd onderzocht in hoofdstuk V. Op basis van gedetailleerde vragenlijsten hebben we de patiënten geïnterviewd. Deze aanpak werd gecombineerd met fylogenetische analyses om de hypotheses te testen die duidelijk werden tijdens de int erviews. Eén overkoepelende besmettingsbron die aan de basis zou liggen van deze epidemie kon niet gevonden worden. Wel werden verschillende kle inere transmissieketens geïdentificeerd en fylogenetisch bevestigd. De H CV genotype 5a epidemie in Vlaanderen is voornamelijk geassocieerd met b loedtransfusies en met het uitvoeren van onhygiënische medische handelin gen. Tot slot hebben we getracht de aandacht te vestigen op het bestaan van H CV recombinante stammen. We vonden een HCV 1a/1c recombinant die maar li efst vijf breekpunten vertoont. Dit is de eerste keer dat een HCV recomb inant met meerdere breekpunten wordt gerapporteerd. We concluderen dat de resultaten van deze thesis algemeen bijdragen tot een beter begrip van de epidemiologie en evolutionaire aspecten van HCV.status: publishe

Detection of Perinatal Cytomegalovirus Infection and Sensorineural Hearing Loss in Belgian Infants by Measurement of Automated Auditory Brainstem Response▿

Since auditory disability causes serious problems in the development of speech and in the total development of a child, it is crucial to diagnose possible hearing impairment as soon as possible after birth. This study evaluates the neonatal hearing screening program in Flanders, Belgium. The auditory ability of 118,438 babies was tested using the automated auditory brainstem response. We selected 194 babies with indicative hearing impairment and 332 matched controls to investigate the association between the presence of human cytomegalovirus (HCMV) in urine samples and sensorineural hearing loss and to analyze the sensibility and specificity of a cell culture assay and a quantitative PCR detection method. Our results indicate that significantly more babies with confirmed hearing impairment were HCMV positive after birth. Further, based on the results of our study, babies with HCMV viral loads above 4.5 log copies/ml urine seem to be 1.4 times more likely to have confirmed hearing impairment. Our follow-up study suggests that the hearing impairment of children infected with HCMV after birth is less likely to improve than that of HCMV-negative infants. Our results confirm that the presence of HCMV before or shortly after birth influences the outcome of hearing impairment

Antiviral Activity of Chloroquine against Human Coronavirus OC43 Infection in Newborn Mice▿

Until recently, human coronaviruses (HCoVs), such as HCoV strain OC43 (HCoV-OC43), were mainly known to cause 15 to 30% of mild upper respiratory tract infections. In recent years, the identification of new HCoVs, including severe acute respiratory syndrome coronavirus, revealed that HCoVs can be highly pathogenic and can cause more severe upper and lower respiratory tract infections, including bronchiolitis and pneumonia. To date, no specific antiviral drugs to prevent or treat HCoV infections are available. We demonstrate that chloroquine, a widely used drug with well-known antimalarial effects, inhibits HCoV-OC43 replication in HRT-18 cells, with a 50% effective concentration (± standard deviation) of 0.306 ± 0.0091 μM and a 50% cytotoxic concentration (± standard deviation) of 419 ± 192.5 μM, resulting in a selectivity index of 1,369. Further, we investigated whether chloroquine could prevent HCoV-OC43-induced death in newborn mice. Our results show that a lethal HCoV-OC43 infection in newborn C57BL/6 mice can be treated with chloroquine acquired transplacentally or via maternal milk. The highest survival rate (98.6%) of the pups was found when mother mice were treated daily with a concentration of 15 mg of chloroquine per kg of body weight. Survival rates declined in a dose-dependent manner, with 88% survival when treated with 5 mg/kg chloroquine and 13% survival when treated with 1 mg/kg chloroquine. Our results show that chloroquine can be highly effective against HCoV-OC43 infection in newborn mice and may be considered as a future drug against HCoVs

Use of a Commercially Available Line Probe Assay for Genotyping of Hepatitis C Virus 5a Strains

To validate a commercially available line probe assay for samples containing the infrequently found hepatitis C virus (HCV) genotype 5a, we sequenced a 511-nucleotide fragment of the NS4b region of Belgian and South African HCV genotype 5a samples. Phylogenetic analysis of the sequence data was performed. For the 77 HCV genotype 5a samples collected, there was 100% concordance between the genotype assignment by the line probe assay and the genotyping based on nucleotide sequencing, despite sequence heterogeneity in the probe binding sites of some samples

A near-full length genotypic assay for HCV1b

A near-full genome genotypic assay for HCV1b was developed, which may prove useful to investigate antiviral drug resistance, given new combination therapies for HCV1 infection. The assay consists of three partially overlapping PCRs followed by Sanger population or Illumina next-generation sequencing. Seventy-seven therapy-naïve samples, spanning the entire diversity range of currently known HCV1b, were used for optimization of PCRs, of which ten were sequenced using Sanger and of these ten, four using Illumina. The median detection limits for the three regions, 5'UTR-NS2, E2-NS5A and NS4B-NS5B, were 570, 5670 and 56,670IU/ml respectively. The number of Illumina reads mapped varied according to the software used, Segminator II being the best performing (81%). Consensus Illumina and Sanger sequencing results accord largely (0.013% major discordances). Differences were due almost exclusively to a larger number of ambiguities (presumably minority variants) scored by Illumina (1.50% minor discordances). The assay is easy to perform in an equipped laboratory; nevertheless, it was difficult to reach high sensitivity and reproducibility, due to the high genetic viral variability. This assay proved to be suitable for detecting drug resistance mutations and can also be used for epidemiological research, even though only a limited set of samples was used for validation.publisher: Elsevier articletitle: A near-full length genotypic assay for HCV1b journaltitle: Journal of Virological Methods articlelink: http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2014.09.009 content_type: article copyright: Copyright © 2014 Elsevier B.V. All rights reserved.status: publishe

Molecular epidemiology of hepatitis C virus genotype 5a in France (a multicenter ANRS study)

Date du colloque&nbsp;: 10/2009</p

Investigating the Origin and Spread of Hepatitis C Virus Genotype 5a

Epidemiological and phylogenetic studies of hepatitis C virus (HCV) have identified six major HCV genotypes and have attempted to characterize their origin and spread worldwide. Putative regions of endemic infection have been identified for all HCV genotypes except HCV genotype 5a. Although HCV genotype 5a was previously thought to be largely restricted to the northern part of South Africa, this study reports an unexpected cluster of the genotype in West Flanders Province in Belgium. To investigate the molecular epidemiology of this cluster and of HCV genotype 5a in general, a rigorous phylogenetic analysis of Belgian and South African HCV genotype 5a samples was performed. Remarkably, the Belgian and South African strains form two distinct clusters of similar diversity. We used a Bayesian coalescent method to estimate the rate of virus spread through time for HCV genotype 5a in both regions. Our results indicate that HCV genotype 5a strains have been spreading independently in Belgium and South Africa for more than 100 years, with a rate of spread characteristic of an epidemic genotype. These findings have major implications for tracing the origin of HCV genotype 5a. Here, we speculate about the possible origins of these clusters